一种糖化血清白蛋白检测试剂盒制造技术

本发明专利技术针对现有检测血清糖化白蛋白技术存在的缺陷，目的在于提供一种血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于检测血清中糖化白蛋白含量时，使用果糖胺‑6‑激酶直接作用于样本中的糖化白蛋白。所述试剂盒由糖化白蛋白检测部分、总白蛋白检测部分组成、校准品和质控品组成，并主要包括四个检测试剂。与现有的市售试剂盒相比（酮胺氧化酶法），本发明专利技术所提供的试剂盒中的检测试剂可直接作用于血清中的糖化白蛋白，可避免使用蛋白酶所带来的一系列问题，具有成本低、准确性高、性质稳定等特点，便于广泛应用。

A Kit for Detecting Saccharified Serum Albumin

【技术实现步骤摘要】
一种糖化血清白蛋白检测试剂盒
本专利技术属体外诊断领域，具体的说是一种糖化血清白蛋白检测剂盒，用于人体血清糖化白蛋白的定量检测。
技术介绍
糖化血清白蛋白是血液中白蛋白与葡萄糖发生非酶促糖化反应所产生的早期糖基化产物。通常认为糖化血清白蛋白测定可以准确反映人体2-3周的血糖控制情况，大量研究表明，其检测结果在糖尿病治疗效果的确认以及临床用药量的调整方面比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白具有优势。另外，作为糖尿病患者体内早期糖基化产物，糖化白蛋白能破坏内皮细胞功能，导致血管壁的氧化应激和炎症反应、刺激平滑肌细胞增殖和迁移，这些病理过程将导致动脉粥样硬化和糖尿病血管并发症的形成和发展。所以，糖化血清白蛋白含量这一指标在对糖尿病人的血糖控制方面具有重要指导意义。因此，糖化血清白蛋白已经成为临床上重要的血糖指标之一。目前，临床上糖化血清白蛋白检测的常规方法为酮胺氧化酶法，检测过程依赖于酮胺氧化酶与被糖化的果糖氨基酸残基反应。然而，酮胺氧化酶难以直接作用于糖化白蛋白，所以在检测过程中需使用大量蛋白酶预先将糖化白蛋白分解为氨基酸“碎片”，再利用酮胺氧化酶高度选择地与其中果糖氨基酸反应，通过这一过程产生定量的过氧化氢，进而通过Trinder’s反应测定出糖化白蛋白含量（CGA）。与此同时，使用溴甲酚紫测定血清白蛋白总量（CALB），再通过计算两次测定的比值，得到糖化血清白蛋白的百分含量（CGA/CALB*100%）。所以糖化血清白蛋白测定试剂盒通常由糖化白蛋白试剂（下称GA测定试剂）和总白蛋白试剂（下称ALB测定试剂）两部分组成(例如在专利文献CN102565420A及US8105800B2所公布的方法)。在GA测定试剂中，第一试剂（R1）的主要成分为酮胺氧化酶、Trinder’s反应底物、抗干扰物质；第二试剂（R2）的主要成分为蛋白酶和Trinder’s反应底物。理想状态下，将样本与R1混合均匀，消除干扰物质后，加入R2使蛋白酶与糖化白蛋白反应，引发上述Trinder’s反应链，从而测量样本中的糖化白蛋白含量。然而实际上，蛋白酶对所有蛋白质均具有相同的反应性，也就是说，在加入R2后，蛋白酶会使反应体系中所有蛋白质同时降解，这样就会在一定程度上抑制了后续反应的进行。为保证测量结果正确，有必要在试剂盒中大量添加其他酶，如酮胺氧化酶、过氧化氢酶等，使试剂盒的成本增加。另外，蛋白酶本身亦为蛋白质，将其保存在液体试剂中，其自身也会发生降解，造成活性降低，缩短试剂盒的寿命。在开发糖化血清白蛋白检测试剂盒的过程中，我们发现果糖胺-6-激酶可以直接与糖化白蛋白赖氨酸残基上的ε-氨基糖基反应，将其转化为果糖胺-6-磷酸，并且该反应会同时将三磷酸腺苷(ATP)转化为二磷酸腺苷(ADP)。根据这一发现，可以开发一种使用果糖胺-6-激酶为核心原料的糖化血清白蛋白试剂盒。值得注意的是，与现有的测定糖化血清白蛋白方法（酮胺氧化酶法）不同，本专利技术的测定过程是直接发生在糖化白蛋白的糖基上，即在测试中无需使用蛋白酶“切割”糖化白蛋白，这样就避免了测量过程中由于蛋白酶的加入而带来的成本增加及各种问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种糖化血清白蛋白检测定剂盒，其特征在于使用果糖胺-6-激酶为核心反应物质，直接与样本中的糖化白蛋白上的糖基反应，以达到定量测定糖化血清白蛋白的目的。所以，本专利技术的内容包括：[1]一种糖化血清白蛋白检测定剂盒，试剂盒由糖化白蛋白测定部分（CGA测定部分，即下述中试剂R1和试剂R2），总白蛋白测定部分（CALB测定部分，即下述中试剂R3和试剂R4），标准品和质控品组成，其特征是在试剂盒的CGA测定试剂中使用果糖胺-6-激酶；需要特别说明的，本
技术实现思路
中所述的试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4仅为表述方便，并不特指试剂盒中的某一组成部分；[2][1]中所述的CGA测定试剂包含两个试剂，其中试剂R1包含以下成分：0.2~1U/ml胆红素氧化酶、0.1~0.5U/ml维生素C氧化酶、10~40U/ml酮胺氧化酶、2~10mMTOOS、0.5~10U/mlCatalase、10~15mM磷酸烯醇丙酮酸、10~40U/ml丙酮酸激酶、10~15mMATP、10~40U/ml丙酮酸氧化酶、0.01~0.02%硫酸庆大霉素、50~200mMHEPES缓冲液，pH值为6.5~8.0；试剂R2包含以下成分：30~50U/ml果糖胺-6-激酶、25~60U/ml辣根过氧化酶、10~15mMNaN3、5~20mM4-氨基安替比林、50~200mMHEPES缓冲液，pH值为6.5~8.0；[3][1]中所述的CALB测定试剂包含两个试剂，其中R3包含以下成分：20~100mM醋酸-醋酸钠缓冲液、0.1%~2%Brij-35，pH值为4.5~5.5；R4包含以下成分：20~100mM醋酸-醋酸钠缓冲液、0.01%~0.5%溴甲酚紫、10~15mMNaN3，pH值为4.5~5.5；[4][1]中所述的糖化血清白蛋白测定试剂盒的标准品和质控品是用人血清白蛋白与葡萄糖反应一定时间所制备的一系列白蛋白/糖化白蛋白混合溶液，其中真实含量糖化白蛋白含量和白蛋白含量由HPLC方法确定。具体来说，本专利技术的试剂盒的使用包括糖化白蛋白检测和白蛋白检测两个步骤，其中，糖化白蛋白检测：将样本与R1混合，利用酮氨氧化酶消除样本中游离的果糖氨基酸干扰，同时消除血清中的胆红素与维生素C，并用Catalase消除上述反应产生的过氧化氢；此时加入R2，其中NaN3将抑制体系中的Catalase活性，果糖胺-6-激酶与反应体系中的糖化白蛋白反应，同时将ATP转化为ADP，产生的ADP将激活丙酮酸激酶与磷酸烯醇丙酮酸反应产生丙酮酸，再使用丙酮酸氧化酶将丙酮酸氧化产生定量的过氧化氢，最终通过Trinder’s反应测定样本（标准品）中的糖化白蛋白含量，即CGA值。白蛋白检测：溴甲酚紫在Brij-35的作用下，可与测定样本中的白蛋白结合形成复合物，在波长603nm产生吸收，利用该反应可测定样本中白蛋白含量，即CALB值。最后，通过CGA和CALB的比值来确定样本的糖化白蛋白百分含量。附图说明图1相关性检测结果图具体实施方式以下是本专利技术的具体实施例，并对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。实施案例中所使用的试剂如表1所示.表1：实施例中试剂来源实施例1：糖化血清白蛋白检测试剂盒的制备本专利技术中的糖化血清白蛋白检测试剂盒按以下方法制备：[1]按表2配制CGA测定试剂第一试剂，即糖化血清白蛋白试剂盒中R1。表2：CGA测定试剂第一试剂即糖化血清白蛋白试剂盒中R1配方并将其pH值调节至7.20。[2]按表3配制CGA测定试剂第二试剂，即糖化血清白蛋白试剂盒中R2。表3：CGA测定试剂第二试剂即糖化血清白蛋白试剂盒中R2配方并将其pH值调节至7.20。[3]在50mM乙酸-乙酸钠缓冲液中添加1%的Brij-35作为CALB测定试剂的前处理液R3，并将其pH值调节为5.20；用50mM乙酸-乙酸钠缓冲液配制0.01%的溴甲酚紫作为CALB测定试剂的测定试剂R4，并将其pH值调节为5.20；[4]使用人血清白蛋白与葡萄糖室温搅拌反应一定时间制备试剂盒的标准品和质控品，并用HPLC法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征是在测定糖化白蛋白时使用果糖胺‑6‑激酶。

【技术特征摘要】
1.一种血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征是在测定糖化白蛋白时使用果糖胺-6-激酶。2.根据权利要求[1]所述的果糖胺-6-激酶，其特征是可以与糖化白蛋白赖氨酸残基上的ε-氨基糖基反应，并同时将三磷酸腺苷(ATP)转化为二磷酸腺苷(ADP)。3.权利要求[1]所述的血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的各个组成部分的成分如下：试剂R1：胆红素氧化酶0.2~1U/ml维生素C氧化酶0.1~0.5U/ml酮胺氧化酶10~40U/mlTOOS2~10mMCatalase0.5~10U/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伯平，蔡泽浪，邹佳信，黄夏雨，
申请(专利权)人：深圳市安帝宝科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44