本发明专利技术公开了一种高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法；该检测平台由单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片、分泌蛋白捕获玻璃板、芯片夹具三部分组成；其中细胞捕获与液滴孵育微流控芯片有两层结构，分别是单细胞捕获与液滴孵育层、隔离阀层。该平台可高效快速的进行单细胞的捕获，通过隔离相的加入快速稳定的生成含有单个细胞的微液滴并可进行长期的液滴孵育，同时保证单细胞的高活性，将该芯片与分泌蛋白的检测的抗体阵列玻璃板相结合，可实现单细胞分泌蛋白高通量、快速、高灵敏度的检测。
Efficient Single Cell Capture and Rapid Single Cell Secretory Protein Detection Platform and Detection Method
【技术实现步骤摘要】
高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台及检测方法
本专利技术涉及高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，属于微流控单细胞分析方法
技术介绍
传统的细胞研究方法，是基于大量细胞的群体性研究，得到的结果往往是所有细胞的平均结果。而有研究表明同一种类型的细胞，不同细胞个体其基因表达情况以及表型有一定的差异(Zhang,Yetal.(2014)JournaloftheAmericanChemicalSociety136:15257)，称之为细胞的异质性。群体实验得到的实验结果会掩盖了细胞的异质性，影响着癌症的治疗、预后以及复发几率。单细胞研究是指将细胞分散在一个个独立的实验单元中并加以研究，得到独立的实验结果，不会相互影响，因此能够对细胞异质性进行充分的研究，得到更加精确、具有指导性意义的结果，但单细胞的研究要具有较高的通量才能具有很好的统计学意义。分泌蛋白具有促进癌细胞增殖、转移的能力(Konty,Tatal.(2011)Biosensors&bioelectronics26:2707)，对癌细胞进行单细胞分泌蛋白进行研究，有助于理解癌细胞的转移能力以及癌细胞与免疫系统之间的关系。目前，单细胞分泌蛋白的检测主要是将微流控芯片与分泌蛋白捕获工具相结合实现单细胞、多细胞或者血浆中细胞分泌蛋白的检测，并通过荧光信号输出。用于分泌蛋白检测的微流控芯片包括微孔阵列式芯片(Lu,Yatal.(2013)Anal.Chem.85:2548)、鱼骨形液滴生成芯片两大类；其原理都是通过泊松分布来实现单细胞的捕获，因此其存在细胞利用率低、单细胞捕获效率低、试剂浪费严重、检测腔体体积大、检测灵敏度低等问题，因为检测腔体体积较大所以芯片需要超过12小时的孵育才能让分泌蛋白被充分的捕获。缺少一种拥有较小的检测体积使其在较短的孵育时间内能实现快速单细胞分泌蛋白捕获，能允许细胞的微液滴长期孵育，并能保证单细胞的高活性，实现单细胞分泌蛋白高通量、快速、高灵敏度的检测平台。
技术实现思路
本专利技术针对现有单细胞分泌蛋白检测平台单细胞捕获效率低、分泌蛋白检测腔体体积大、单细胞分泌蛋白检测灵敏度低、试剂浪费严重等问题，提出一种能实现单细胞高效率的捕获效率、分泌蛋白检测腔体体积小、分泌蛋白检测灵敏度高、快速单细胞分泌蛋白捕获、节约试剂的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台。本专利技术的技术方案为：高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层(23)和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层(24)；单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道(11)连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道(11)的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道(11)的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，并通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道(7，11)末端相接；分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在多聚赖氨酸玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。在本专利技术中，所述的多个单元之间，可以采用串联方式连接，也可以采用并联方式连接，还可以是串并联混合方式连接。优选地，所述的细胞通道(7，11)、溶液通道(10)、隔离相通道(5)宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。优选地，一个细胞捕获腔体(6)和一个检测通道(9)组成一个孵育单元，在加上一组分泌蛋白捕获抗体条带(20)形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体条带(20)与检测通道(9)内溶液接触。优选地，每个分泌蛋白检测平台中分泌蛋白检测单元的数目为1-50000个。优选地，隔离阀通道(16)宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离通道间隔(14)距离为5-1000微米。优选地，高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台还包括芯片夹具，所述的芯片夹具包括夹具上板和夹具下板，所述的隔离阀层(23)和单细胞捕获与液滴孵育层(24)夹设于夹具上板和夹具下板之间优选地，芯片夹具上板开口宽度为0.1-2厘米，长度为0.1-2厘米。优选地，芯片夹具上板设有螺丝固定开口(30)，以及7个芯片通道开口，分别为细胞通道开口(31，33)、溶液通道开口(32，34)、隔离阀通道开口(35，36)与隔离相入口开口(37)。本专利技术还提供了如前所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台的应用，其运用于单细胞分泌蛋白/胞内蛋白的检测和/或分析。本专利技术还提供一种单细胞分泌蛋白检测方法，包括如下步骤：1)根据前述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台结构，制备细胞捕获与液滴孵育微流控芯片，和分泌蛋白捕获玻璃板；2)在与多聚赖氨酸捕获玻璃板热键合的修饰芯片腔体中通入捕获抗体，进行分泌蛋白捕获抗体阵列的修饰；修饰好后，使用缓冲液进行封闭，然后洗涤，最后将分泌蛋白捕获玻璃板旋干；3)将单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片与单细胞分泌蛋白捕获玻璃板工作区域对齐、贴合并固定；芯片浸泡在超纯水中；对单细胞进行捕获；A、先往隔离阀通道(16)内注入超纯水，使其压力变大，引起隔膜(29)向下形变，将检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)和溶液通道(10)隔离开来；B、反向从隔离相入口(5)与溶液通道出口(4)通入隔离相，在细胞捕获腔体(6)中生成一个个带有单细胞的液滴，C、待液滴阵列生成后应关闭气泵开关，静置，然后将气管拔出，将隔离阀通道入口(12，13)的水管拔出，释放隔离阀通道(16)压力，隔膜(29)形貌复原，不再有隔离效果，使检测通道(9)与细胞捕获腔体(6)重新连通，组成单细胞孵育单元，在将芯片的出入口使用胶带封闭；。4)接着将平台放入细胞培养箱中，进行细胞液滴的孵育，在整个孵育过程中单细胞处于细胞捕获腔体中，分泌蛋白通过扩散作用转移到细胞检测通道，被分泌蛋白捕获抗体阵列所捕获；将经过孵育后的单细胞分泌蛋白捕获玻璃板，从芯片上拆解下来，并检测单细胞分泌蛋白捕获玻璃板上的信号，分析出单细胞分泌蛋白的分泌情况。优选地，步骤(3)对单细胞进行捕获，细胞浓度控本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：所述的检测平台包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层；单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，检测通道(9)通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道末端相接；分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。...
【技术特征摘要】
1.高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：所述的检测平台包括细胞捕获与液滴孵育微流控芯片和分泌蛋白捕获玻璃板；其中，单细胞捕获与液滴孵育微流控芯片包括：位于上层的隔离阀层和位于下层的单细胞捕获与液滴孵育层；单细胞捕获与液滴孵育层包括多个单元，每个单元包括位于细胞流动通道左右两端的直形细胞流动通道(7)，两个直形细胞流动通道(7)之间使用U形或弧形细胞流动通道连接，还包括细胞捕获腔体(6)，所述细胞捕获腔体(6)连接有3条通道，第一条通道为细胞流动通道，连接U形或弧形细胞流动通道的一臂端，该通道的宽度大于待捕获细胞直径；第二条通道为连接通道(8)，宽度小于待捕获细胞直径，用于连接细胞捕获腔体(6)与U形或弧形细胞流动通道的另一臂端；第三条通道为检测通道(9)，检测通道(9)通向溶液通道(10)；溶液通道(10)两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离阀层包括两条流动方向相反的隔离阀通道(16)，所述两条隔离阀通道分别和检测通道(9)交叉；隔离阀通道(16)和检测通道(9)之间设隔膜(29)；细胞溶液入口(1)与出口(3)在细胞流动通道两端，溶液通道两端分别有一个溶液入口(2)和一个溶液出口(4)；隔离相通道的入口(5)与细胞流动通道末端相接；分泌蛋白捕获玻璃板包括：表面修饰有多聚赖氨酸的玻璃板(26)，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)修饰在玻璃板(26)上；分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)位于检测通道(9)内，并处于两条隔离阀通道(16)和检测通道形成的两个交叉点之间，分泌蛋白捕获抗体阵列条带(20)面向检测通道(9)并与检测通道(9)内的溶液直接接触。2.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：细胞流动通道、溶液通道(10)、隔离相通道(5)宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；检测通道宽度为5-1000微米，长度为5-1000微米，高度为5-200微米。3.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：一个细胞捕获腔体(6)和一个检测通道(9)组成一个孵育单元，孵育单元加上一组分泌蛋白捕获抗体条带(20)形成一个细胞分泌蛋白检测单元；分泌蛋白捕获抗体条带(20)与检测通道(9)内溶液接触。4.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于：隔离阀通道(16)宽度为5-1000微米，高度为5-1000微米，两隔离通道间隔(14)距离为5-1000微米。5.如权利要求1所述的高效单细胞捕获与快速单细胞分泌蛋白检测平台，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，黄培烽，张明霞，莫诗，朱志，周雷激，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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