IL-6/PCT联合检测时间分辨检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，利用稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的IL‑6/PCT联合检测时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术检测试剂盒能够准确定量检测人血清、血浆和全血样本中白介素6和降钙素原的含量，通过滤血膜样品垫的处理可实现样本无需预处理和稀释液稀释，利用时间分辨荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，稀土钒酸盐纳米材料具有背景低，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将稀土钒酸盐纳米颗粒与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点。

Time-resolved Kit and Method for IL-6/PCT Joint Detection

【技术实现步骤摘要】
IL-6/PCT联合检测时间分辨检测试剂盒及方法(一)
本专利技术涉及一种IL-6/PCT联合检测时间分辨荧光检测试剂盒及方法。(二)
技术介绍
白介素6(IL-6)是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。IL-6及其受体与炎症性疾病的有关，它是多功能炎性细胞因子，在炎症反应中起重要作用。IL-6水平上升可作为炎症反应的早期指标，并可用于评估系统性炎症反应综合征的严重程度(SIRS)。当炎症反应发生后，IL-6血清浓度的升高早于其他生物标志物，浓度升高后诱导PCT和CRP的产生。患者血清中IL-6的浓度水平在感染早期快速升高，2小时内达到峰值，相比PCT和CRP更为灵敏，在感染早期更有利临床预测，动态观察IL-6水平有助于了解疾病进展并确认疗效。同时，IL-6也是评估脓毒症患者预后的优秀标志物。降钙素原是一种功能蛋白，是降钙素合成过程中的中间产物，是无激素活性的降钙素前肽物质。健康人血浆PCT含量极低，在正常人血中低于0.5ng/ml，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度，是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。在脓毒症的全病程管理中，IL-6和PCT联合检测可以取长补短，提高诊断的准确率。IL-6在早期预警及评估预后方面优势突出，而PCT在辅助诊断、评估检测抗生素疗效方面非常有效。联合检测IL-6和PCT可以避免单一指标对感染类别判断的误差，提高感染的早期诊断，及时帮助临床确定患者的治疗方案，具有重要临床价值。现有技术中炎症感染及脓毒症检测仅针对单一的炎症指标进行检测，另外IL-6检测试纸条较少，且测定IL-6/PCT的方法主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、胶体金法等。其中胶体金法具有操作简单快速的优点，但灵敏度低且定量不准确；免疫比浊法较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的；免疫荧光法是将IL-6/PCT抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的荧光素等发色团进行荧光检测时灵敏度就会严重下降，但大部分背景荧光信号是短时存在的，可利用稀土纳米材料(镧系元素螯合物)作为标记物来标记抗体或抗原。稀土纳米材料是一种广泛使用的生物标记物，与传统标记物相比，稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。钒酸盐在深紫外的吸收截面较大，是优良的荧光标记材料，稀土离子掺杂的钒酸盐发光材料由于稀土离子具有丰富的能级，可以在不同能级之间跃迁，大大提高稀土钒酸盐纳米材料的光学性能。因此采用稀土钒酸盐纳米荧光标记材料作为标记物，利用时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，利用稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的IL-6/PCT联合检测时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒及方法。本专利技术采用的技术方案是：一种IL-6/PCT联合检测时间分辨荧光检测试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡和含有定标曲线的ID卡：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述滤血膜样品垫处喷涂有包含异嗜性抗体阻断剂的样品垫处理液，玻璃纤维结合垫处设置有微球线，喷涂有时间分辨荧光微球标记的单克隆抗体IL-61、单克隆抗体PCT1以及兔IgG抗体(含量分别为50～200μg抗体/200μl荧光微球)，所述时间分辨荧光微球为稀土钒酸盐颗粒(组成为LnVO4:xEu，优选为GdVO4:30％Eu)，LnVO4为基质，其中Ln为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种，基质优选为GdVO4，掺杂离子为铕(Eu3+)，冒号“：”表示为铕掺杂；x为摩尔百分数，范围是5％～50％，优选为30％，粒径为100nm～300nm；所述时间分辨荧光微球在基态下稳定，在250～350nm的激发光源作用下发射出波长范围在600～620nm的荧光；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线1、2和质控线，检测线1、2和质控线分别包被单克隆抗体IL-62、单克隆抗体PCT2和羊抗兔抗体，检测线1、2和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中检测线2靠近结合垫，质控线远离结合垫；检测线1为单克隆抗体IL-62、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，检测线2为单克隆抗体PCT2、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜,质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜；所述检测试纸条由如下方法制备：(1)稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的制备方法在50mL圆底烧瓶中，按摩尔比例，加入2份蒸馏水，(1-x)份Ln的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x份Eu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x为摩尔百分数，范围是5％～50％，1份原钒酸,(1～5份)柠檬酸或柠檬酸钠，用氢氧化钠调节pH值6～8，通入氮气，85℃反应24小时，10000rpm离心，用蒸馏水洗涤3次，干燥得到分散性好的水溶性LnVO4:xEu纳米荧光探针。LnVO4为基质优选为GdVO4，掺杂离子为铕(Eu3+)，其摩尔百分数优选为30％。所述的GdVO4:30％Eu材料结构为纯四方相结构，尺寸约为250nm且形貌均一，发光性能好。(2)时间分辨荧光微球的活化超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml；(3)时间分辨荧光微球分别标记IL-6、PCT单克隆抗体IL-61、PCT1和兔IgG抗体的制备在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照50～200μg/200μl分别加入IL-6、PCT单克隆抗体IL-61、PCT1和兔IgG，混匀1～3小时，用含0.5％BSA、0.1％甘氨酸的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后14000rpm高速离心5～15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.5％蔗糖、0.1％Tween20的10～5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IL‑6/PCT联合检测时间分辨荧光检测试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡和含有定标曲线的ID卡，其特征在于：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述检测试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述滤血膜样品垫处喷涂有包含异嗜性抗体阻断剂的样品垫处理液；所述玻璃纤维结合垫处设置有微球线，喷涂有时间分辨荧光微球标记的单克隆抗体IL‑6 1、单克隆抗体PCT 1以及兔IgG抗体，含量分别为50～200μg抗体/200μl荧光微球，所述时间分辨荧光微球为稀土钒酸盐纳米颗粒，粒径为250±50nm，其组成为LnVO4:xEu，其中，LnVO4为基质，Ln为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种；冒号“：”表示为铕掺杂；x为Eu的摩尔百分数，范围是5％～50％；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线1、2和质控线，检测线1、2和质控线分别包被单克隆抗体IL‑6 2、单克隆抗体PCT2和羊抗兔抗体，检测线1、2和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中检测线2靠近结合垫，质控线远离结合垫；检测线1包被单克隆抗体IL‑6 2、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，检测线2包被单克隆抗体PCT2、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。...

【技术特征摘要】
1.一种IL-6/PCT联合检测时间分辨荧光检测试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡和含有定标曲线的ID卡，其特征在于：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述检测试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述滤血膜样品垫处喷涂有包含异嗜性抗体阻断剂的样品垫处理液；所述玻璃纤维结合垫处设置有微球线，喷涂有时间分辨荧光微球标记的单克隆抗体IL-61、单克隆抗体PCT1以及兔IgG抗体，含量分别为50～200μg抗体/200μl荧光微球，所述时间分辨荧光微球为稀土钒酸盐纳米颗粒，粒径为250±50nm，其组成为LnVO4:xEu，其中，LnVO4为基质，Ln为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种；冒号“：”表示为铕掺杂；x为Eu的摩尔百分数，范围是5％～50％；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线1、2和质控线，检测线1、2和质控线分别包被单克隆抗体IL-62、单克隆抗体PCT2和羊抗兔抗体，检测线1、2和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中检测线2靠近结合垫，质控线远离结合垫；检测线1包被单克隆抗体IL-62、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，检测线2包被单克隆抗体PCT2、包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线中羊抗兔IgG抗体包被浓度为0.3～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测试纸条由如下方法制备：(1)稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的制备方法在50mL圆底烧瓶中，按摩尔比例，加入2份蒸馏水，(1-x)份Ln的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x份Eu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x为摩尔百分数，范围是5％～50％，1份原钒酸，(1～5份)柠檬酸或柠檬酸钠，用氢氧化钠调节pH值6～8，通入氮气，85℃反应24小时，10000rpm离心，用蒸馏水洗涤3次，干燥得到分散性好的水溶性LnVO4:xEu纳米荧光探针；(2)时间分辨荧光微球的活化超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml；(3)时间分辨荧光微球分别标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，张肖，宋良，
申请(专利权)人：厦门稀土材料研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35