用于测量血浆肾素活性的方法和系统技术方案

公开了用于样品中定量AngI和/或测定血浆肾素活性的方法和系统。本文公开的方法和系统可以用于诊断高血压、醛甾酮增多症及肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)的其它异常。

Method and system for measuring renin activity in plasma

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量血浆肾素活性的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求2016年11月17日提交的美国临时申请No.62/423,550的权益，将其全部内容通过援引并入本文。专利
本专利技术涉及用于测定血浆肾素活性的方法和系统。
技术介绍
血浆肾素活性(PRA)衡量周围血液产生肽血管紧张素I(AngI)的能力，并且在诊断肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)的病症方面很重要。在RAAS中，本质上由肝脏产生的血管紧张素原被肾素水解，形成AngI，肾素是一种由肾脏肾球旁小体产生的酶。AngI可以被血管紧张素转换酶(ACE)切割，产生血管紧张素II(AngII)，血管紧张素II是一种强有力的血管收缩剂和大量下游RAAS作用的调节剂(mediator)。测量肾素活性在鉴别诊断患有高血压的个体中是有用的。在患有由于肾动脉狭窄引起的高血压(即，肾血管性高血压)的患者中，肾素水平升高。测量肾素活性在诊断原发性醛甾酮增多症中也是有用的。患有继发性醛固酮症的患者往往具有低肾素水平。肾素活性也可以用于评价患有肾上腺功能不全的患者中类固醇替代的适当性。肾素活性在具有足够补充的患者中将是正常的，当类固醇替代不足时，其将会升高。因此，存在测量血浆肾素活性的改进的实验室试验的需要。需要更经济有效的改进的实验室试验，从而允许更频繁地试验以及更快地提供给临床医师试验结果。专利技术简述本专利技术提供用于测定血浆肾素产生血管紧张素I(AngI)的活性的方法和系统，血管紧张素I在诊断肾素血管紧张素醛固酮系统的病症中很重要。在某些实施方案中，本专利技术包括一种通过质谱和/或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测量AngI生成的方法。在某些实施方案中，本专利技术包括一种证实正确的样品类型为EDTA-血浆的方法。本专利技术可以以多种方式具体描述。在一个实施方案中，本专利技术包括一种测定样品中AngI的量的方法。所述方法可以包括在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:1)的AngI肽的条件下培养样品；加入蛋白酶或化学水解试剂；在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；电离所述AngI裂解产物，产生一个或多个质谱可检测的离子；和通过质谱检测所述AngI裂解产物离子。在某些实施方案中，所述方法可以包括使用内标准。例如，所述方法可以包括向样品中加入稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)作为内标准的步骤。如下述详细讨论的，内标准可选自多种合适的标准。在某些实施方案中，SIL-AngI为肽NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQIDNO:3)，其中^指重同位素标记的氨基酸。例如，在一个实施方案中，V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。注意到，存在其他实施方案，其中SIL-AngI为肽NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:1)其中许多氨基酸组合可以用重同位素标记，不限于本文研究的实施例中使用的内标准(SEQIDNO:3)。内标准提供一种定量每个步骤的AngI肽和/或AngI裂解产物的量的方式。在可替代的实施方案中，在血浆肾素介导的AngI生成之前或之后，但是在加入蛋白酶步骤之前，加入SIL-AngI肽。因此，在某些实施方案中，AngI裂解产物的量与蛋白酶产生的SIL-AngI裂解产物的量成正比。所述方法也可包括外部校准(即，参考)标准，其提供了已知量的AngI与样品比较，以便定量样品AngI。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括产生多数校准标准的步骤，所述校准标准包括在合适的基质中已知量的AngI，其中所述参考标准为SEQIDNO：1的AngI，其经历与样品AngI相同的步骤。在某些实施方案中，外部校准标准没有经历所有测定步骤，但是在最后的电离和质谱的步骤加入。因此，在某些实施方案中，通过比较样品中AngI的量与多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。校准标准通常应当包括涵盖样品中AngI的预期范围的浓度范围。例如，在某些实施方案中，校准标准包括范围0.25至100ng/mL的AngI。或者，可以使用更大或更窄的范围。所述方法包括产生用于MS/MS测量的AngI衍生物。在某些实施方案中，所述衍生物是通过用蛋白酶培养样品AngI生成的。在某些实施方案中，蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。例如，在一个实施方案中，蛋白酶为胰蛋白酶。例如，蛋白酶裂解产生具有序列NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:2)的AngI裂解产物。在某些实施方案中，蛋白酶产生具有序列NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQIDNO:4)的SIL-AngI裂解产物。在某些实施方案中，所述AngI衍生物(即，裂解产物)是水解产生的。例如，在某些实施方案中，化学水解试剂为甲酸、乙酸、盐酸或能够水解AngI的任何其它试剂。当AngI裂解产物为SEQIDNO:2的AngI时，AngI离子选自具有质/荷比为513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。类似地，其中SIL-AngI裂解产物为SEQIDNO:4的SIL-AngI，所述SIL-AngI离子选自具有质/荷比为524.3±2、779.5±269.2±2的离子。所述方法中可以包括其它步骤。例如，在某些实施方案中，所述方法可以包括在蛋白酶消化的步骤之前终止血浆肾素活性的步骤。如下述更详细地讨论的，可以使用多种化学试剂和/或物理处理(例如，加热)终止血浆肾素活性。例如，在某些实施方案中，向样品中加入甲醇终止血浆肾素活性。当加入有机溶剂(例如，甲醇)时，所述方法可以进一步包括蒸发溶剂(例如，甲醇)，然后在蛋白酶消化步骤之前在缓冲液中重构样品的步骤。可以在质谱之前，进一步纯化样品中的AngI裂解产物(和内标准)以及任选的校准标准。例如，在某些实施方案中，所述方法包括在质谱之前使AngI裂解产物进行液相色谱的步骤。如本文详细讨论的，可以使用多种质谱方法。在一个实施方案中，电离室是具有选择反应监测(SRM)的正电喷雾电离。可以使用多种样品，在某些实施方案中，样品为得自患者的生物流体。例如，在某些实施方案中，生物流体为血浆。在一个实施方案中，血浆包括作为抗凝血剂的乙二胺四乙酸(EDTA)。在某些实施方案中，样品被证实为包含EDTA的血浆样品。因此，所述方法可以包括从样品移出等分试样，并且在培养步骤产生AngI之前检验EDTA的存在。在一个实施方案中，EDTA存在的检测包括加入比色试剂邻-甲酚酞络合酮，与样品中的钙离子反应，使得包括EDTA的样品保持颜色基本上不变，而不具有EDTA的样品由于钙与比色试剂反应引起颜色变化。所述方法还是一种根据任一项前述实施方案的测量血浆肾素活性(PRA)的方法，其中基于样品中AngI肽的量计算PRA的水平。在一个实施方案中，血浆肾素活性定义为每单位时间产生AngI的量。例如，在某些实施方案中，血浆肾素活性表示为ng/mL/hr。在一个实施方案中，血浆肾素活性具有从约0.167-66.667ng/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定样品中AngI的量的方法，所述方法包括∶(a)在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2‑DRVYIHPFHL‑COOH(SEQ ID NO:1)的AngI肽的条件下培养样品；(b)加入蛋白酶或化学水解试剂；(c)在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；(d)电离AngI裂解产物，产生一种或多种质谱可检测的离子；和(e)通过质谱检测AngI裂解产物离子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.17 US 62/423,5501.一种测定样品中AngI的量的方法，所述方法包括∶(a)在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:1)的AngI肽的条件下培养样品；(b)加入蛋白酶或化学水解试剂；(c)在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；(d)电离AngI裂解产物，产生一种或多种质谱可检测的离子；和(e)通过质谱检测AngI裂解产物离子。2.权利要求1的方法，进一步包括向样品中加入作为内标准的稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)。3.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI为肽NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQIDNO:3)，其中^指用重同位素标记的氨基酸。4.权利要求3的方法，其中V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。5.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI是使用用重同位素标记的其它氨基酸组合由肽NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:1)生成的。6.权利要求2的方法，其中在血浆肾素介导的AngI生成之前或之后，但在加入蛋白酶步骤之前，加入所述SIL-AngI肽。7.权利要求2的方法，其中AngI裂解产物的量与蛋白酶产生的SIL-AngI裂解产物的量成正比。8.权利要求1的方法，进一步包括产生多数校准标准的步骤，所述校准标准包括在合适的基质中已知量的AngI，其中所述参考标准为SEQIDNO：1的AngI，其经历与样品AngI相同的步骤。9.权利要求8的方法，其中通过比较样品中AngI的量与多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。10.权利要求9的方法，其中所述校准标准包括范围为0.25至100ng/mL的AngI。11.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。12.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。13.权利要求1的方法，其中所述化学水解试剂为甲酸、乙酸、盐酸或能够水解AngI的任何其它试剂。14.权利要求1的方法，其中蛋白酶裂解产生具有序列NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQIDNO:2)的AngI裂解产物。15.权利要求3的方法，其中所述蛋白酶产生具有序列NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQIDNO:4)的SIL-AngI裂解产物。16.权利要求1的方法，其中所述AngI离子选自具有质/荷比为513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。17.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI离子选自具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·O·斯莱德，R·P·格兰特，C·M·舒夫特，
申请(专利权)人：美国控股实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US