一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂技术

本发明专利技术公开了一种体液样本中细胞PD‑L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂，特点是包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD‑L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD‑L1的蛋白表达，其中免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM‑1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种，优点是具有操作简单、灵敏度高和检测结果易判读。

A method for detecting the expression of PD-L1 protein in human body fluid samples and its special reagent

【技术实现步骤摘要】
一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂
本专利技术属于蛋白的免疫组化检测领域，尤其是涉及一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂。
技术介绍
PD-1是I型跨膜免疫球蛋白受体，属于CD28介导的免疫反应超家族成员，是T细胞表面的重要抑制分子，其胞内段含有一个ITIM和一个免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM），ITSM介导了蛋白酪氨酸磷酸酶家族磷酸酶的募集以及对T细胞活化信号的抑制。PD-1的受体包括PD-L1（B7-H1）与PD-L2（B7-DC），主要在免疫系统效应期的肿瘤微环境中发挥重要作用。PD-L1在多种肿瘤细胞和肿瘤微环境的造血细胞中有诱导性的表达，通过与PD-1的结合，诱导产生机体的免疫抑制，从而使肿瘤细胞获得免疫逃逸，这也许是肿瘤耐受的机制之一。如果将其结合阻断，就有可能阻断这种免疫抑制，使机体自身的T细胞活化，从而达到免疫治疗的目的。PD-L1抑制剂能阻断了PD-1和PD-L1的结合，使肿瘤细胞对T细胞“松绑”，恢复被肿瘤细胞削弱的免疫功能。PD-L1抑制剂对多种肿瘤治疗有效且副作用小，但其也并非“万能药”，因个体差异，导致药效也有所不同，单独使用客观缓解率仅有15-30%。为判定抑制剂是否对患者有效，需要进行PD-L1相关的检测。目前，市场上还没有单一的指标可以明确地告诉患者该药物是否有效，但可以检测PD-L1的抗体表达水平来进行评估药效。PD-L1抗体的检测主要是基于细胞蛋白水平的检测，临床试验中以免疫组化方法为主，即对手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片－染色（通过抗体），根据着色深浅来评价表达情况。到目前为止，免疫组化方法（用于检测PD-L1抗体）适用于组织，尚未提及是否可用于胸腹水、骨髓及外周血等肿瘤细胞的PD-L1蛋白表达检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有操作简单、灵敏度高和检测结果易判读的体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD-L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD-L1的蛋白表达。所述的免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种。所述的免疫磁微粒的制备方法具体步骤如下：（1）磁微粒的预处理：在含有磁微粒的离心管中加入0.05mol/LMES缓冲液，将离心管置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，向离心管中加入等量的0.05mol/LMES缓冲液，进行超声处理后，置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，重复上述步骤2-4次；在离心管中再次加入0.5mL0.05mol/LMES缓冲液，继续在超声仪中进行超声处理，得到大小一致、形状完整以及分布均匀的磁微粒悬浮液；其中MES缓冲液一次添加量为每2mg磁微粒添加1mLMES缓冲液；磁微粒为粒径200-1000nm的棕色圆形或椭圆形磁微粒，羧基含量为200μmol/g-600μmol/g；（2）磁微粒活化：在磁微粒悬浮液中分别加入50mg/mLNHS溶液活化剂和50mg/mLEDAC溶液活化剂，然后置于可调式旋转混合器上，于25~40rpm、37±2℃反应30min后，加入HEPS缓冲液进行润洗，置于磁力架上重复洗涤2-4次，吸弃上清得到活化后磁微粒；其中NHS溶液、EDAC溶液和HEPS缓冲液的添加量为每2mg磁微粒添加100μLNHS溶液、100μLEDAC溶液和1mLHEPS缓冲液；（3）磁微粒偶联抗体：在含有活化后磁微粒的离心管中加入抗体密封后，放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速混匀10-14小时，得到包被了抗体的免疫磁微粒；其中抗体添加量为每2mg磁微粒添加10μg抗体，所述的抗体为抗人EpCAM抗体、抗人ICAM-1抗体、抗人EGFR抗体、抗人叶酸受体抗体、抗人CD10抗体、抗人CD19抗体、抗人CD20抗体或者抗人CD33抗体。在含有包被了抗体的免疫磁微粒的离心管中迅速加入75mg/mL的封闭剂和100mg/mL的BSA溶液，在漩涡混合器上混匀后，将离心管放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速封闭2小时；将离心管取下，加入清洗液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用清洗液重复洗涤2-4次后，加入保存液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用保存液重复洗涤2次，最后用保存液重悬免疫磁微粒，得到无团聚的免疫磁微粒溶液；其中各成分单次添加量为每2mg磁微粒添加200μL封闭剂、200μLBSA溶液、1mL清洗液和1mL保存液，所述的封闭剂为75mg/mL的甘氨酸水溶液，所述的清洗液为含0.1%曲拉通和0.53%吐温20的0.9wt%氯化钠溶液，所述的保存液为含1.6wt%BSA的HEPS液。所述的免疫磁微粒捕获仪为免疫磁微粒捕获仪CellRichTM，设置程序为：样本量为1.0-7.5mL，捕获速度为1.0-5.0mL/h，冲洗速度为2.0-7.0mL/h。所述的PD-L1免疫组化染色试剂的一抗为型号MAB1561或ab205921的抗人PD-L1抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG或辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。所述PD-L1免疫组化染色试剂的一抗浓度为0.5mg/ml、二抗浓度为0.8mg/ml、封闭液为含有5vt%山羊血清的TBST缓冲液以及显色液为DAB显色剂。2、一种用于体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂，所述的试剂包括免疫磁微粒混合液，所述的免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种。3、一种用于体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂的应用，所述的免疫磁微粒混合液在制备肺癌患者CTCs捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒和抗人叶酸受体免疫磁微粒的混合质量比为2：2：2：4；所述的免疫磁微粒混合液在制备肺癌患者肺癌胸腹水CTCs捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒和抗人叶酸受体免疫磁微粒的混合质量比为4：4：1：1；所述的免疫磁微粒混合液在制备白血病幼稚细胞捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒的混合质量比为1：1：4：4。4、一种用于体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂，所述的试剂包括PD-L1免疫组化染色试剂，所述的PD-L1免疫组化染色试剂的一抗为型号MAB1561或ab205921的抗人PD-L1抗体，二抗为辣本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体液样本中细胞PD‑L1蛋白表达的检测方法，其特征在于包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD‑L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD‑L1的蛋白表达。

【技术特征摘要】
1.一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD-L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD-L1的蛋白表达。2.根据权利要求1所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：所述的免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种。3.根据权利要求2所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于所述的免疫磁微粒的制备方法具体步骤如下：（1）磁微粒的预处理：在含有磁微粒的离心管中加入0.05mol/LMES缓冲液，将离心管置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，向离心管中加入等量的0.05mol/LMES缓冲液，进行超声处理后，置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，重复上述步骤2-4次；在离心管中再次加入0.5mL0.05mol/LMES缓冲液，继续在超声仪中进行超声处理，得到大小一致、形状完整以及分布均匀的磁微粒悬浮液；其中MES缓冲液一次添加量为每2mg磁微粒添加1mLMES缓冲液；磁微粒为粒径200-1000nm的棕色圆形或椭圆形磁微粒，羧基含量为200μmol/g-600μmol/g；（2）磁微粒活化：在磁微粒悬浮液中分别加入50mg/mLNHS溶液活化剂和50mg/mLEDAC溶液活化剂，然后置于可调式旋转混合器上，于25~40rpm、37±2℃反应30min后，加入HEPS缓冲液进行润洗，置于磁力架上重复洗涤2-4次，吸弃上清得到活化后磁微粒；其中NHS溶液、EDAC溶液和HEPS缓冲液的添加量为每2mg磁微粒添加100μLNHS溶液、100μLEDAC溶液和1mLHEPS缓冲液；（3）磁微粒偶联抗体：在含有活化后磁微粒的离心管中加入抗体密封后，放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速混匀10-14小时，得到包被了抗体的免疫磁微粒；其中抗体添加量为每2mg磁微粒添加10μg抗体，所述的抗体为抗人EpCAM抗体、抗人ICAM-1抗体、抗人EGFR抗体、抗人叶酸受体抗体、抗人CD10抗体、抗人CD19抗体、抗人CD20抗体或者抗人CD33抗体。4.根据权利要求3所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：在含有包被了抗体的免疫磁微粒的离心管中迅速加入75mg/mL的封闭剂和100mg/mL的BSA溶液，在漩涡混合器上混匀后，将离心管放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速封闭2小时；将离心管取下，加入清洗液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用清洗液重复洗涤2-4次后，加入保存液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用保存液重复洗涤2次，最后...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓晶，沈挺，宋毅，
申请(专利权)人：宁波美晶医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33