用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法及其应用，特点是：包括利用静电作用在基底的上表面覆盖一层聚电解质多层膜，然后利用粘附作用在该聚电解质多层膜的上表面覆盖一层脂质层，形成纳米结构表面芯片，优点是：能够实现血液中循环肿瘤细胞的高灵敏度、高特异性捕获，且能够方便有效地进行循环肿瘤细胞释放，不损伤循环肿瘤细胞及其生物活性，更利于细胞再培养和后续分析。

Preparation and application of nanostructured surface chips for the capture and release of circulating tumor cells

【技术实现步骤摘要】
用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法及应用
本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法及应用。
技术介绍
当今社会，癌症正在严重危害人类健康。研究证实，恶性肿瘤患者临床致死的主要原因为肿瘤的侵袭和转移。肿瘤转移是指具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发病灶，以极少的数量转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官中。而这些从原发灶脱落、侵袭并进入血液循环的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells，CTCs)，其是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能。因此，对外周血液中的循环肿瘤细胞进行检测可用来反映肿瘤转移行为、肿瘤侵袭性，且对癌症治疗效果判断及早期肿瘤预测具有十分重要的意义。虽然循环肿瘤细胞分选对癌症临床治疗具有很大的指导价值，但循环肿瘤细胞的捕获和检测仍面临诸多挑战。首先，循环肿瘤细胞在外周血中的数量极少，平均在106-107个白细胞中有1个。其次，目前传统的循环肿瘤细胞的捕获方法主要可分为：基于物理性质分离捕获法和特异性识别分离捕获法，前者一般通过循环肿瘤细胞相比血液中的白细胞、红细胞而言，其大小、密度、黏附性等物理性质上的差异来进行CTC捕获；后者一般采用抗体、核酸适配体、免疫磁微粒等物质识别循环肿瘤细胞表面特定抗原，来进行CTC捕获。但上述方法进行CTC捕获时容易使循环肿瘤细胞产生损伤，使细胞的形态有缺失或者一定程度上降低了细胞的生物活性，对后续细胞再培养和分析造成一定影响；且上述方法通常在捕获后进行循环肿瘤细胞洗脱时存在困难，不能进行迅速有效地释放，因此不便于后续培养以及其他的生化分析。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，及其在捕获与释放循环肿瘤细胞中的应用，能够实现血液中CTCs的高灵敏度、高特异性捕获，且能够方便有效进行CTC细胞释放，不损伤CTC细胞及其生物活性，更利于细胞再培养和后续分析。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，包括：利用静电作用在基底的上表面覆盖一层聚电解质多层膜，然后利用粘附作用在该聚电解质多层膜的上表面覆盖一层脂质层。具体包括以下步骤：（1）使用超纯水与聚阳离子A材料混合制备浓度为0.04～0.06mol/L的聚阳离子A溶液，使用超纯水与聚阳离子B材料混合制备浓度为0.005～0.015mol/L的聚阳离子B溶液，以及使用超纯水与聚阴离子材料混合制备浓度为0.005～0.015mol/L的聚阴离子溶液，分别将聚阳离子A溶液、聚阳离子B溶液及聚阴离子溶液调至pH值2.5～3.5后经0.45μm滤膜过滤，得到聚阳离子A电解液、聚阳离子B电解液以及聚阴离子电解液，备用；（2）在基底上表面的细胞捕获区域滴加聚阳离子A电解液，使聚阳离子A电解液能够覆盖细胞捕获区域，反应12～20min后，用与聚阳离子A电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阳离子A电解液；（3）在细胞捕获区域继续覆盖滴加聚阴离子电解液，反应3～8min后，用与聚阴离子电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阴离子电解液；（4）在细胞捕获区域继续覆盖滴加聚阳离子B电解液，反应3～8min后，用与聚阳离子B电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阳离子B电解液，在基底的上表面形成聚电解质多层膜，将聚电解质多层膜置于37℃烘箱内，干燥3～5小时后室温保存；（5）使用超纯水与脂质材料混合制备浓度为0.008～0.012mol/L的脂质水溶液，将脂质水溶液调至pH值2.5～3.5后，室温下进行超声处理，使脂质充分溶解得到脂质溶液；（6）在聚电解质多层膜上滴加脂质溶液，反应3～8min后，用与脂质溶液相同pH值的超纯水清洗1～3次，去除多余的脂质溶液，在聚电解质多层膜上制得脂质层，聚电解质多层膜与脂质层相结合形成纳米结构表面，将制备完成的纳米结构表面芯片放置在干燥箱内进行干燥。所述的聚阳离子A材料为聚烯丙基胺盐酸盐，所述的聚阳离子B材料为聚丙烯酰胺，所述的聚阴离子材料为聚甲基丙烯酸。所述的步骤（1）中制备的烯丙基胺盐酸盐溶液的浓度为0.05mol/L，聚丙烯酰胺溶液的浓度为0.01mol/L，甲基丙烯酸溶液的浓度为0.01mol/L。所述的聚阳离子A电解液、所述的聚阳离子B电解液、所述的聚阴离子电解液和所述的脂质溶液的pH值均为3。由此能够保证制得溶液的导电性。所述的脂质材料为1,2-二油酸-甘油-3-磷脂酰胆碱。所述的步骤（5）中超声的功率为40～60kHz，超声的时间为60～90min。所述的基底为载玻片；所述的聚电解质多层膜与所述的脂质层的厚度总和为0.2～0.3mm。一种所述的纳米结构表面芯片在捕获与释放循环肿瘤细胞中的应用，包括以下步骤：（1）循环肿瘤细胞捕获：将纳米结构表面芯片安装至捕获仪的捕获盒内，并安装配套使用的捕获耗材包及配套试剂，将预处理后的血液样品装载于捕获仪中，将血液样品以0.01～1μL/min的速率通过纳米结构表面芯片的表面，用磷酸盐缓冲溶液进行清洗，清洗速度为45～50μL/min，循环肿瘤细胞附着在该芯片的纳米结构表面，血液中其他细胞在该清洗速度下被冲洗出；（2）循环肿瘤细胞释放：将磷酸盐缓冲溶液依次以50μL/min、60μL/min、70μL/min、80μL/min的速率通过纳米结构表面芯片的表面，对循环肿瘤细胞进行梯度洗脱，循环肿瘤细胞从纳米结构表面芯片上被洗脱至洗脱液中。在步骤（2）循环肿瘤细胞释放之后还包括循环肿瘤细胞收集：将洗脱液于室温、700g条件下离心5mim，收集底部沉淀，往底部沉淀中加入固定液，轻柔吹打，重悬沉淀细胞，即得循环肿瘤细胞。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：通过在基底表面的细胞捕获区域上覆盖聚电解质多层膜和脂质层，两者分别以静电作用和粘附作用进行叠加，相结合形成用于捕获循环肿瘤细胞的纳米结构表面，循环肿瘤细胞较血液中其他细胞如红细胞、白细胞等其黏附性强，由此循环肿瘤细胞经过本专利技术修饰后的纳米结构表面芯片表面时，利用其与修饰表面之间的亲和作用，循环肿瘤细胞被吸附并以悬浮固定的方式附着在芯片表面上，不损伤循环肿瘤细胞，较好保留其生物活性；当循环肿瘤细胞释放时，在特定的流速下即可从表面上洗脱下来，洗脱方便，且释放的循环肿瘤细胞的形态较为完整，具有良好的生物活性，更利于进行细胞再培养、分子水平分析及耐药性研究等。附图说明图1为本专利技术一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片及其应用的结构示意图；图2为本专利技术一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的捕获原理示意图；图3为本专利技术实施例五中MCF-7细胞的荧光成像图；a为用CD45-Alexa594荧光标记的荧光成像图，b为用CK-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，其特征在于包括：利用静电作用在基底的上表面覆盖一层聚电解质多层膜，然后利用粘附作用在该聚电解质多层膜的上表面覆盖一层脂质层。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，其特征在于包括：利用静电作用在基底的上表面覆盖一层聚电解质多层膜，然后利用粘附作用在该聚电解质多层膜的上表面覆盖一层脂质层。


2.根据权利要求1所述的一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）使用超纯水与聚阳离子A材料混合制备浓度为0.04～0.06mol/L的聚阳离子A溶液，使用超纯水与聚阳离子B材料混合制备浓度为0.005～0.015mol/L的聚阳离子B溶液，以及使用超纯水与聚阴离子材料混合制备浓度为0.005～0.015mol/L的聚阴离子溶液，分别将聚阳离子A溶液、聚阳离子B溶液及聚阴离子溶液调至pH值2.5～3.5后经0.45μm滤膜过滤，得到聚阳离子A电解液、聚阳离子B电解液以及聚阴离子电解液，备用；
（2）在基底上表面的细胞捕获区域滴加聚阳离子A电解液，使聚阳离子A电解液能够覆盖细胞捕获区域，反应12～20min后，用与聚阳离子A电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阳离子A电解液；
（3）在细胞捕获区域继续覆盖滴加聚阴离子电解液，反应3～8min后，用与聚阴离子电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阴离子电解液；
（4）在细胞捕获区域继续覆盖滴加聚阳离子B电解液，反应3～8min后，用与聚阳离子B电解液相同pH值的去离子水清洗1～3次，去除多余的聚阳离子B电解液，在基底的上表面形成聚电解质多层膜，将聚电解质多层膜置于37℃烘箱内，干燥3～5小时后室温保存；
（5）使用超纯水与脂质材料混合制备浓度为0.008～0.012mol/L的脂质水溶液，将脂质水溶液调至pH值2.5～3.5后，室温下进行超声处理，使脂质充分溶解得到脂质溶液；
（6）在聚电解质多层膜上滴加脂质溶液，反应3～8min后，用与脂质溶液相同pH值的超纯水清洗1～3次，去除多余的脂质溶液，在聚电解质多层膜上制得脂质层，聚电解质多层膜与脂质层相结合形成纳米结构表面，将制备完成的纳米结构表面芯片放置在干燥箱内进行干燥。


3.根据权利要求2所述的一种用于捕获与释放循环肿瘤细胞的纳米结构表面芯片的制备方法，其特征在于所述的聚阳离子A材料为聚烯丙基胺盐酸盐，所述的聚阳离子B材料为聚丙烯酰胺，所述的聚阴离子材料为聚甲基丙烯酸。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张晓晶，沈挺，宋毅，
申请(专利权)人：宁波美晶医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33