本发明专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌中通过非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白，以及利用该蛋白作为转运信号实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的一种新型策略。
技术介绍
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是工业生产中重要的蛋白质生产菌株。因为强大的蛋白质分泌能力、安全菌种的定位（GRAS,generallyrecognizedassafe）、遗传易操作性、无密码子偏好性以及发酵成本低廉等特征，枯草芽孢杆菌吸引了众多科学研究者的目光。在枯草芽孢杆菌中，大多数蛋白质以未折叠状态通过Sec途径被转运到胞外，少数蛋白（如PhoD和YwbN）以折叠状态通过Tat途径分泌到培养基中，还有一些蛋白通过ABC转运子途径、Com途径和ESX途径等方式进行分泌。目前，在蛋白分泌相关研究中，绝大多数蛋白是在经典信号肽（Sec信号肽或Tat信号肽）的指导下分泌到胞外，但是大多蛋白质的分泌效果往往并不理想。在经典分泌途径（Sec途径和Tat途径等）中的每一过程均可能成为限制蛋白质分泌的因素。此外，一般情况下，细胞质蛋白即使在信号肽的指导下也很难被分泌到细胞外的培养基中。以上因素限制了枯草芽孢杆菌在蛋白质生产上的应用。除了可通过上述已知分泌途径分泌的蛋白，细菌中还存在一些不带有任何信号肽及其它分泌信号的分泌型蛋白，这些蛋白的分泌机制尚不清楚，因此被称为非经典分泌蛋白。通过计算机软件计算，枯草芽孢杆菌可以分泌大约300种蛋白质。到目前为止，在枯草芽孢杆菌中，通过2D-电泳和质谱技术已鉴定出113种分泌蛋白，其中84种含有经典的信号肽（Sec信号肽和Tat信号肽）并在信号肽的指导下分泌到胞外；而其它分泌蛋白却均不含有任何经典的信号肽或分泌信号序列。Antelman等通过蛋白质组学鉴定出了17种可分泌到胞外的典型细胞质蛋白（Antelmanetal.MicrobialProteomics:FunctionalBiologyofWholeOrganisms2006,JohnWiley&Sons,Inc.,Hoboken,NJ,USA）；Tjalsma等列举了24种不带有信号肽且可分泌到胞外的蛋白质，并认为在细菌中不依赖信号肽的蛋白分泌现象可能比之前认为的更为普遍（Tjalsmaetal.Microbiol.Mol.Biol.Rev.2004,68:207）。Vitikainen等在枯草芽孢杆菌中对折叠酶PrsA进行结构功能分析时发现了一些非经典分泌蛋白，比如糖类代谢相关的蛋白Eno、PdhB、PdhD和CitH，目前尚不知这些蛋白在胞外是否具有功能（Vitikainenetal.JBiolChem2004,279:19302-19314）。Antelman等最初发现涉及氨基酸代谢的酶RocA和RocF是通过非经典途径分泌的（Antelmanetal.GenomeRes2001,11:1484-502），但是后来Vitikaimen证明只有RocF是非经典分泌蛋白。Hirose等鉴定出具有运动性和趋药性的蛋白Hag是存在胞外的（Hiroseetal.Microbiology2000,146:65-75），随后同类蛋白FlgK和FliD也被鉴定位于胞外（Antelmanetal.GenomeRes2001,11:1484-502），这三种蛋白在胞外均具有已知功能。过氧化氢酶KatA缺少信号肽，因此开始被认为是一种胞内酶，但是其后来被证明同样可以分泌到胞外（占总蛋白的56%）（Naclerioetal.ApplEnvironMicrobiol1995,61:4471-4473）。此外，SodA、YceD、Ef-G和GroEL等蛋白也被不同研究人员在胞外检测到。当然，在胞外环境中检测到非经典分泌蛋白很容易被认为是细胞裂解而导致细胞质蛋白发生泄漏的缘故。然而，Yang等人已证实一种异源的蛋白Est55和几种不含有信号肽的自身细胞质蛋白不是因为细胞裂解而泄漏到胞外，而是通过一种或某种未知的分泌途径被转运到胞外环境中（Yangetal.JournalofBacteriology2011,193:5607-5615）。事实上，众多来自不同研究组关于不同菌种的研究已表明非经典分泌蛋白在枯草芽孢杆菌中是真实存在的。尽管非经典分泌的机制尚未清楚，但是研究人员已开始尝试将非经典分泌系统应用到蛋白生产中。最近，Wang等人选择了4种枯草芽孢杆菌自身非经典分泌蛋白来尝试引导异源蛋白分泌，结果4种蛋白均可以引导Nsp（Nucleoskeletallikeprotein）分泌到胞外，其中2种可以指导碱性磷酸酶PhoA的分泌，一种可以将耐高温β-半乳糖苷酶BgaB转运到胞外（Wangetal.MicrobCellFact2015,14:179）。尽管这些蛋白的分泌量大多很低，只能用Western-blotting的方法进行检测，但是证明了非经典分泌蛋白可以应用在蛋白质分泌表达中。因此，为了补充枯草芽孢杆菌的蛋白分泌途径，以及拓展枯草芽孢杆菌表达系统的使用范围，更多的非经典分泌蛋白需要被发掘并应用到重组蛋白的生产中。本专利技术证明了来源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE是一种在枯草芽孢杆菌中的非经典分泌蛋白，并以该非经典分泌蛋白为分泌信号引导多个不同来源的目标蛋白实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是证明来源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE是一种在枯草芽孢杆菌中可通过非经典分泌途径进行分泌的蛋白。所述的非经典分泌途径不是枯草芽孢杆菌中Sec途径和Tat途径等已知经典分泌途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄漏的现象，而是一种未知的全新的蛋白分泌途径。所述的异源蛋白RDPE的核酸序列如SEQIDNO.1所示，且其不含有经典的信号肽和分泌信号序列。所述的枯草芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104或以上菌株后代细胞中的一种。本专利技术的目的之二是提供一种利用非经典分泌蛋白RDPE并通过非经典分泌途径实现蛋白分泌表达的方法，即非经典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表达中的应用，是将RDPE与候选目标蛋白进行融合并构建一系列重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，分别转化到枯草芽孢杆菌菌株后进行筛选培养，多达50%的目标蛋白可成功分泌到胞外。所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP包含非经典分泌蛋白RDPE的编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在枯草芽孢杆菌中可通过非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白RDPE，其特征在于，其是来源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖 3‑差向异构酶。
【技术特征摘要】
1.一种在枯草芽孢杆菌中可通过非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白RDPE，其特征在
于，其是来源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
2.根据权利要求1所述的非经典分泌途径，其特征在于，其并非枯草芽孢杆菌中Sec分
泌途径和Tat分泌途径等已知经典途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄
漏现象，而是一种未知的全新的蛋白分泌途径。
3.根据权利要求1所述的异源蛋白RDPE，其特征在于，其核酸序列如SEQIDNO.1所示
且不含有任何经典的信号肽和分泌信号序列。
4.根据权利要求1和2所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其是枯草芽孢杆菌168、
WB600、WB700、WB800、1A751、DB104或以上菌株后代细胞中的一种。
5.一种利用权利要求1所述异源蛋白RDPE并通过权利要求1和2所述非经典分泌途径实
现蛋白分泌表达的方法，即非经典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表达中的应用，其特征在于，将
RDPE与候选目标蛋白进行融合并构建一系列重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，分别转化到枯草
芽孢杆菌菌株后进行筛选培养，多达50%的融合蛋白成功分泌到胞外。
6.根据权利要求5所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其包含非经典分泌
蛋白RDPE的编码序列、21-bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序
列。
7.根据权利要求6所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其中的21-bp的柔
性Linker序列为5’-GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’。
8.根据权利要求7所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，其中的目标蛋白分
别为枯草芽孢杆菌来源的GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、XylA、Pel、PhoA(BS)、LipA、PhoD、YwbN
和PrsA，其它细菌来源的LacZ、PhoA(EC)、BgaB、AmyS和AmyL以及真核生物来源的GFP和RFP。
9.根据权利要求8所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，其特征在于，该质粒还包含组成
型强启动子PHpaII。
10.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，陈景奇，赵留群，孙际宾，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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