雷公藤二萜合酶TwGES1及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了雷公藤二萜合酶TwGES1及其编码基因与应用。本发明专利技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Twges1基因，该基因是首次从雷公藤中得到的二萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明专利技术的TwGES1蛋白能够催化GGPP形成香叶基芳樟醇((E,E)‑geranyllinalool)，也能催化FPP形成橙花叔醇((E)‑nerolidol)，不仅对雷公藤中的雷公藤甲素等二萜类化合物的生物合成具有重要作用，也对于调节和生产植物二萜类化合物及培育高品质的雷公藤具有重要的理论及实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药用植物基因工程领域，具体涉及雷公藤二萜合酶TwGES1及其编码基因与应用。
技术介绍
药用植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)是一味中草药，被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗(RaphaelaGM,MildredW,RoyF,etal.ComparisonofTripterygiumwilfordiiHookFVersusSulfasalazineintheTreatmentofRheumatoidArthritis:ARandomizedTrial[J].AnnalsofInternalMedicine,2009,151(4):229-240；TaoXL,LipskyPE.TheChineseanti-inflammatoryandimmunosuppressiveherbalremedyTripterygiumwilfordiiHookF.[J].RheumaticDiseaseClinicsofNorthAmerica,2000,26(1):29–50.)。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。从中药中的活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。雷公藤中以雷公藤甲素为代表的二萜类化合物具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、免疫抑制等活性(ZhouZL,YangYX,DingJ,etal.Triptolide:structuralmodifications,structure-activityrelationships,bioactivities,clinicaldevelopmentandmechanisms.[J].NaturalProductReports,2012,29(4):457-475.)。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonicacid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate，IPP)及其异构体Dimethylallylpyrophosphate(DMAPP)。再由此分别生成单萜(monoterpenes)、倍半萜(sesquiterpenes)、二萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyldiphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyldiphosphate，FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)。二萜合酶(diterpenesynthase)，又称二萜环化酶(diterpenecyclase)能够催化GGPP形成各种二萜骨架，被认为是合成萜类次生代谢终产物的关键酶(TrappSC,CroteauR.GenomicOrganizationofPlantTerpeneSynthasesandMolecularEvolutionaryImplications.Genetics,2001,158:811–832)。因此，二萜合酶的挖掘和鉴定尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为TwGES1：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。其中，序列2由848个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1第62-2608位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。本专利技术的第二个目的是提供与TwGES1蛋白质相关的生物材料。本专利技术提供的与TwGES1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码TwGES1蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1第62-2608位所示的cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TwGES1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TwGES1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码TwGES1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TwGES1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TwGES1且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述严格条本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1第62-2608位所示的cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，黄璐琦，苏平，周家伟，胡添源，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京;11