一种瑞香狼毒总二萜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，属于植物提取技术领域。瑞香狼毒中总二萜由乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相中压柱层析分离等三步获得。所制得的瑞香狼毒总二萜中的二萜含量高达90％以上。本方法采用反相ODS柱，依次以80％与95％甲醇溶液进行洗脱，有效除去了非二萜类杂质，工艺合理，并且本方法成本低廉，操作步骤简单，易于放大，非常适合规模化生产。

A preparation method of a total of two terpene Stellerachamaejasme

The invention discloses a preparation method of Stellerachamaejasme total two terpenes, which belongs to the field of plant extraction technology. In two the total terpenes of Stellera chamaejasme by ethanol extraction, ethyl acetate extraction and reversed-phase medium pressure column chromatography separation step three. The two of the total terpene content of Stellera chamaejasme L. two terpene in above 90%. The method uses a reversed-phase ODS column, followed by 80% and 95% methanol elution, effectively remove non two terpenoid impurities, reasonable process, and this method has the advantages of low cost, simple operation, easy amplification, very suitable for large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种瑞香狼毒总二萜的制备方法
本专利技术属于植物提取
，涉及一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，特别是涉及一种采用萃取技术和反相ODS柱层析技术联用提取制备瑞香狼毒中总二萜的方法。
技术介绍
瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)系瑞香科狼毒属植物，俗名断肠草，分布于中、俄、蒙、朝等国，在我国主要产自北方各省区及西南地区，生于海拔2600～4200米干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。其味苦辛，性平，有大毒，入肺脾肝经，根入药，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有很好的抗肿瘤活性，最新研究还发现其具有抗病毒、抗菌、抗惊厥和免疫调节等作用。目前，从瑞香狼毒中分离鉴定出的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、黄酮类、香豆素类、木脂素类等，其中，瑞香狼毒中的二萜类成分含量极低，但具有很好的药理活性。如尼地吗啉(gnidimacrin)对人类白血病K562，胃癌Kato-Ⅲ、MKN-28、MKN-45等细胞系均具有强烈的抑制作用，其IC50值可达0.12ng/mL(FengW,etal.CHINESEJCANCERRES,1996.17(02))；狼毒酯A～C(stelleralideA～C)显示出潜在的抗HIV活性，其EC90值低至1nM(AsadaY,etal.ORGLETT,2011.13(11))；荛花酯J(wikstroelideJ)抑制人类非小细胞肺癌细胞A549的IC50值为0.024μM，而机理研究进一步证明荛花酯J是拓扑异构酶Ⅱ的良好抑制剂，它能有效地诱导肿瘤细胞在G2～M期的凋亡(LiuL,etal.BIOORGANMEDCHEM,2014.22(15))。诸如此类，文献中对瑞香狼毒二萜药理作用研究的报道有很多，但鲜有对其提取制备方法的报道，这说明从事这方面的研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术在前期研究瑞香狼毒化学成分的基础上，提供了一种快速制备瑞香狼毒药材中总二萜的新工艺。以瑞香狼毒药材为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相ODS中压柱层析等步骤，所得流份直接减压浓缩至干即可获得目标成分含量大于90％的瑞香狼毒总二萜部位。步骤为：(1)取瑞香狼毒药材，粉碎，置于提取釜中，加入无水乙醇浸泡2～3小时后，在减压下50～60℃水浴加热前煮，冷凝回流，提取3～4次，每次2～4小时。合并提取液，负压下干燥至无醇味，得浸膏。(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，重复3～4次。之后放去水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物。(3)将上述萃取物以甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过反相层析柱，依次以两个不同浓度的甲醇-水溶液洗脱，中压泵加压，流量控制在100～150mL/min，收集第二个甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜。上述步骤(1)中按液料比计提取药材所用无水乙醇的体积为药材质量的8～10倍。上述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积为浸膏质量的5～7倍，萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2～3倍。上述步骤(3)中分散萃取物所用甲醇-水溶液的体积浓度为80～85％，其体积为萃取物质量的1～2倍。上述步骤(3)中反相柱层析所用填料为ODS，粒径为40～50μm。上述步骤(3)中两次洗脱所用甲醇-水溶液的体积浓度依次为80～85％和95～100％，洗脱后收集第二次洗脱的甲醇-水流份。综上所述，本专利技术具有的优点为：(1)采用无水乙醇冷浸法与减压回流煎煮法结合，提取充分。(2)采用纯水分散、乙酸乙酯萃取的方法除去大部分水溶性杂质，减少了后续上柱的样品量，同时减轻了对反相柱分离的干扰，使ODS对二萜的分离能力大大增强，更能适应规模化提取的需要。(3)反相层析柱首先以80％甲醇-水洗脱，除去含量较高的黄酮、香豆素等成分，之后以95％甲醇-水洗下所有二萜类成分，也避免如脂肪酸等弱极性成分的引入。(4)提取、萃取及反相柱层析等操作均在较低温度下进行，有效减少了二萜类成分的分解。(5)本专利技术工艺简单，产品目标成分含量高、色泽好，非常适合大规模生产。附图说明图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC)；(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。图2为紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分含量的标准曲线。具体实施方式现结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明，实施例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。实施例1取瑞香狼毒药材1kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入8L无水乙醇浸泡2小时后，水浴50℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次2小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏115g。将浸膏用0.6L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入1.2L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干，得萃取物66g。将萃取物以70mL80％甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过40～50μmODS反相层析柱(柱长40cm，内径8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在100mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜4.4g。采用UPLC-MS对实施例1所得瑞香狼毒总二萜进行定性分析，采用提取离子流色谱图(EIC)及生成分子式的方法初步鉴定出16个含量较高的文献已报道二萜类化合物。由此可知，所得总二萜样品的主要成分为二萜类化合物。具体结果如表1及附图1；图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC)；(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。(色谱条件：流动相为甲醇(B)/水(A)，0～20min，80％～100％B；20～30min，100％B。质谱条析：采用正离子模式，毛细管温度320℃，干燥气流速8L/min，喷雾压力45psig，毛细管电压3500V，碎片电压175V，扫描电压65V，四级杆射频电压750V，质荷比范围100-2000，其他参数为默认。)表116种瑞香狼毒总二萜中初步鉴定的二萜类化合物以wikstroelideM为对照品(自制)，采用紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分的含量。对照品溶液用甲醇配制，浓度范围为1.56～25μg/mL，设定检测波长260nm，分别测定各浓度下的吸光度，并以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得线性方程为y＝0.0401x+0.014，相关系数R2＝0.9999。取实施例1所得瑞香狼毒总二萜，用甲醇溶解，稀释成浓度为15μg/mL的溶液，测得吸光度为0.575，计算得二萜类成分含量为93.27％。相关实验数据见表2及附图2。表2对照品wikstroelideM的浓度与吸光度实施例2取瑞香狼毒药材2kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入13L无水乙醇浸泡2小时后，水浴55℃,在减压下煎煮3次，冷凝回流，每次2小时。之后合并3次提取液，负压干燥得浸膏227g。将浸膏用1.4L纯水超声分散后，在分液漏斗中，加入3L乙酸乙酯萃取，重复3次。之后放去水层，将合并的乙酸乙酯层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取瑞香狼毒药材，粉碎，置于提取釜中，加入无水乙醇浸泡2～3小时后，在减压下50～60℃水浴加热前煮，冷凝回流，提取3～4次，每次2～4小时，合并提取液，负压下干燥至无醇味，得浸膏；(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，重复3～4次，之后放去水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物；(3)将上述萃取物以甲醇‑水溶液分散后，湿法上样，过反相层析柱，依次以两个不同浓度的甲醇‑水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在100～150mL/min，收集第二个甲醇‑水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜。

【技术特征摘要】
1.一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取瑞香狼毒药材，粉碎，置于提取釜中，加入无水乙醇浸泡2～3小时后，在减压下50～60℃水浴加热前煮，冷凝回流，提取3～4次，每次2～4小时，合并提取液，负压下干燥至无醇味，得浸膏；(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，重复3～4次，之后放去水层，合并乙酸乙酯层，在负压下蒸干，得萃取物；(3)将上述萃取物以甲醇-水溶液分散后，湿法上样，过反相层析柱，依次以两个不同浓度的甲醇-水溶液充分洗脱，中压泵加压，流量控制在100～150mL/min，收集第二个甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒总二萜。2.如权利要求1所述的一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中按液料比计提取药...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖红斌，王志鑫，洪志来，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21