一种高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种高热稳定性的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用，该突变体在D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的第116位的丝氨酸突变为异亮氨酸，第251位的赖氨酸突变为亮氨酸，得到的双突变体酶S116I/K251L。本发明专利技术将Burkholderia sp.MR1的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶BsDPE的第116位丝氨酸（Ser，S）突变为异亮氨酸（Ile，I），第251位的赖氨酸（Lys，K）突变为亮氨酸（Leu，L），由此得到的双突变体酶S116I/K251L的热稳定性得到显著提高，其在60℃的半衰期从野生型的337.3min提高到现在的417.9min，为野生型的1.24倍，大大延长了合成D‑阿洛酮糖过程中酶的使用周期，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）的突变体及其应用。
技术介绍
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-Psicose-3-Epimerase,简写为DPE）属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位羟基的差向异构，如催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，是生产稀有糖D-阿洛酮糖的很好的生物催化剂。由于自然界中D-阿洛酮糖的含量极少且极难获得，生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。蛋白定向进化技术成为改造蛋白质分子的一种有效的新策略后，在不需要知道蛋白三维结构的前提下就可快速产生工业上有巨大应用价值的新酶，极大地推动了酶工程在制药、食品、环保等领域的快速发展。由于野生型DPE酶在热稳定性、催化活性等方面不能完全满足工业化生产需求，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。韩国CJ第一制糖株式会社在根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensATCC33970来源的DPE酶基础上进行了定点突变（公开号CN104160023A），获得了热稳定性得到提高的I33L/S213C突变体，其在55℃条件下的半衰期从野生型DPE的10min提高到265min，热稳定性得到显著提高。江南大学在梭状芽孢杆菌ClostridiumbolteaeATCCBAA-613的DPE基础上获得了Y68I/G109P突变体（公开号CN103849612A），热稳定性和催化活性均有所提高。然而，热稳定性好的DPE酶的资源仍然偏少，不利于D-阿洛酮糖的工业化应用推广。利用蛋白定向进化技术对野生型DPE酶进行改造，以获得高活性的、适合工业应用的DPE酶突变体，将是生物法制备D-阿洛酮糖产业发展的关键。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体。本专利技术的另一目的是提供表达上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的载体或宿主菌。本专利技术还有一目的是提供上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的第116位的丝氨酸突变为异亮氨酸，第251位的赖氨酸突变为亮氨酸，得到的双突变体酶S116I/K251L。表达所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体的重组载体或宿主菌。所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体在制备D-阿洛酮糖中的应用。所述的重组载体或宿主菌在表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体中的应用。所述的重组载体或宿主菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。本专利技术还提供了酶突变体的构建方法，具体如下：1.以来源于Burkholderiasp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶BsDPE-pET29a（+）质粒为模板，利用易错PCR技术对BsDPE进行随机突变，构建突变体库；2.挑取约400个单克隆，于96孔板中进行活化、诱导、表达和活性测定；3.将96孔板置于60℃热处理6h后，再利用HPLC来检测每个突变体的催化活性，从中筛选出催化活性有显著提高的突变体；4.将上述催化活性显著提高的突变体菌株送出去测序，并与野生型PsDPE序列进行比对，从而得到热稳定性得到显著提高的S116I/K251L双突变体。所述来源于Burkholderiasp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶BsDPE的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了DPE酶突变体表达菌株的构建方法，具体为，通过引物在目的基因两端分别引入NdeI和BamHI限制性内切酶位点，经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后，与经过同样双酶切的pET29a（+）载体进行连接，并转化BL21（DE3），从而构建DPE酶的体外异源表达体系。DPE酶及其突变体表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k或pMA5等，表达宿主可以为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。有益效果：与现有技术相比，本专利技术将Burkholderiasp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶BsDPE的第116位丝氨酸（Ser，S）突变为异亮氨酸（Ile，I），第251位的赖氨酸（Lys，K）突变为亮氨酸（Leu，L），由此得到的双突变体酶S116I/K251L的热稳定性得到显著提高，其在60℃的半衰期从野生型的337.3min提高到现在的417.9min，为野生型的1.24倍，大大延长了合成D-阿洛酮糖过程中酶的使用周期，具有重要的工业应用价值。附图说明图1是D-果糖标准品在HPLC上的保留时间结果图；图2是D-阿洛酮糖在HPLC上的保留时间结果图；图3是野生型DPE酶（◆）和K122A/G195P突变体（■）在60℃的稳定性结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不是限制本专利技术的范围。以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。实施例1、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体库的建立以全基因合成的BsDPE-pET29a（+）质粒（由常州基宇生物技术有限公司合成，质粒上克隆有编码SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列）为模板，以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库。引物序列如下：F1:5'-GGAATTCCATATGAACAAAGTGGGC-3'；R1：5'-CGCGGATCCTTATGCCAGTTTTTC-3'，两端分别带有NdeI和BamHI限制性酶切位点。易错PCR反应体系如下：10*PCRbuffer2.5μL，10mMdGTP0.5μL，10mMdTTP0.5μL，10mMdCTP2.5μL，10mMdATP2.5μL，1mMMnCl22.5μL，55mMMgCl22.5μL，10μMF11μL，10μMR11μL，Template（10ng/μL）1μL，TaqDNApolymerase（5U/μL，takara）0.2μL，ddH2O补齐至25μL。易错PCR在Bio-RadT100thermalcycler上进行，PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；15℃forever。将上述PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收880bp大小的片段（具体操作见天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒操作规程），并经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后，与经过同样双酶切的pET29a（+）（Novagen）载体进行连接，并转化BL21（DE3）(购自天根生化科技(北京)有限公司)，于37℃倒置过夜培养后，即得到DPE突变体库，长出的单克隆用于活性筛选。实施例2突变体的活化和诱导表达从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至装有1mL含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高热稳定性的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，其特征在于，在D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的第116位的丝氨酸突变为异亮氨酸，第251位的赖氨酸突变为亮氨酸，得到的双突变体酶S116I/K251L。

【技术特征摘要】
1.一种高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，其特征在于，在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的第116位的丝氨酸突变为异亮氨酸，第251位的赖氨酸突变为亮氨酸，得到的双突变体酶S116I/K251L。2.表达权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：余允东，祝俊，
申请(专利权)人：上海立足生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31