羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途制造技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其用途。羰基还原酶ChKRED20可以不对称还原2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮得到替格瑞洛中间体(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇(e.e.值>99％)，利用易错PCR技术和单点饱和突变技术对该酶分子进行定向进化，得到了11个酶活提高1.6‑10倍的突变体，显示了在生物催化中的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其用途。
技术介绍
光学活性(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇是阿斯利康公司研发的药物替格瑞洛(Ticagrelor，商品名“Brilinta”)的关键手性中间体。替格瑞洛是首个在2011年通过FDA认证的可逆的P2Y12受体抗结剂，用于阻止动脉硬化，治疗急性冠状动脉综合征。酮还原酶(EC1.1.1.X，X＝1，2)也被称为羰基还原酶(Carbonyl reductase，CR)或醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)，它们可逆地催化酮或者醛还原为醇，并需要辅因子的参与。微生物细胞或者微生物来源的羰基还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。天然酶在工业应用中普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造是提高酶学性能的有效手段。羰基还原酶ChKRED20可以不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮得到替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(e.e.值>99％)，利用分子进化技术，进一步提高该酶的催化活力，从而推动其在该中间体生产中的工业化应用。
技术实现思路
本专利技术利用易错PCR技术和单点饱和突变技术对来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)的羰基还原酶ChKRED20进行分子改造，从而获得活性提高的羰基还原酶ChKRED20突变体。为了达到以上目的，首先以易错PCR技术对母本基因进行随机突变，建立突变文库，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，通过高通量筛选体系筛选出2个酶活提高的突变位点(H145L和L205M)，并对这两个位点分别建立饱和突变文库，筛选出活性提高的突变体。其中，突变子L205A的酶活比母本提高10倍。本专利技术通过如下方式来实现：(1)随机突变文库的构建和筛选羰基还原酶ChKRED20来源于金黄杆菌CA49(吴中柳，刘艳等，一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产，中国专利，CN 103497911B)，该酶基因大小为750bp，编码249个氨基酸，在NCBI的登录号：KC342020。首先，利用易错PCR技术构建了随机突变文库，得到超过2×104个克隆的突变体文库，将突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。而后离心收集菌体，加入溶菌酶破碎细胞，并离心，取部分上清液(粗酶液)以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物，反应适当时间测定酶活。将羰基还原酶ChKRED20母本作为对照组，筛选得到的活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序列信息。详细方案见实例1。经上述随机突变库构建和筛选，获得了2个活性提高的突变体，分别为H145L、L205M，其特征如下：H145L:该酶的第145位的组氨酸突变为亮氨酸(DNA序列由CAT变为CTT)。L205M:该酶的第205位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由CTG变为ATG)。(2)对这两个位点进行饱和突变通过设计兼并引物，利用定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)对羰基还原酶ChKRED20第145，205位点分别进行饱和突变，得到～1000个克隆的突变体文库，将突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，各挑选100个单克隆于96孔板中表达蛋白进行高通量筛选。进一步筛选到比母本羰基还原酶ChKRED20酶活提高的突变体H145A、L205T、L205Q、L205S和L205A。由于在第145位饱和突变文库中，突变子H145A的活力较高，因此以突变子H145A为母本，在第205位点进行饱和突变，同上述步骤，筛选到组合突变子H145A/L205A、H145A/L205T、H145A/L205Q和H145A/L205V。上述活力提高的突变体其特征如下：H145A：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)。L205T：该酶的第205位的亮氨酸突变为苏氨酸(DNA序列由CTG变为ACG)。L205Q：该酶的第205位的亮氨酸突变为谷氨酰胺(DNA序列由CTG变为CAG)。L205S：该酶的第205位的亮氨酸突变为丝氨酸(DNA序列由CTG变为AGC)。L205A：该酶的第205位的亮氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CTG变为GCC)。H145A/L205A：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第205位的亮氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CTG变为GCG)。H145A/L205T：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第205位的亮氨酸突变苏氨酸(DNA序列由CTG变为ACG)。H145A/L205Q：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第205位的亮氨酸突变为谷氨酰胺(DNA序列由CTG变为CAG)。H145A/L205V：该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第205位的亮氨酸突变为缬氨酸(DNA序列由CTG变为GTG)。这些突变体H145L、L205M、H145A、L205T、L205Q、L205S、L205A、H145A/L205A、H145A/L205T、H145A/L205QH和H145A/L205V的活性与母本羰基还原酶ChKRED20相比均有不同程度提高。突变子L205A活性提升幅度最大，稳定性和产物e.e值却未受影响，酶活为178.3μmol/mg/min，是野生型的10倍。本专利技术有益效果：上述所有酶活提高的突变子与母本相比，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，催化底物的时空效率均有提高，其中突变子L205A转化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的时空效率高达33.3g/(L.h)，具有良好的工业应用前景。除此之外，母本羰基还原酶ChKRED20最多可转化浓度为150g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，而突变子L205A可以在20h内完全转化200g/L的该底物，e.e值不变(>99％)，突变子生物催化大幅度提高了转化能力，可进一步降低生产成本。附图说明图1为母本羰基还原酶ChKRED20与所筛选出的突变体的比活力比较图2为母本羰基还原酶ChKRED20与突变体L205A的最适反应温度测定图，母本羰基还原酶ChKRED20的最适反应温度测定曲线用□表示；突变体L205A的最适反应温度测定曲线用■表示。图3为母本羰基还原酶ChKRED20与突变体L205A在40℃条件下转化底物的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮时间曲线，母本羰基还原酶ChKRED20转化底物的浓度分别为100g/l(○)，150g/l(□)和200g/l(◇)；以及突变体L205A的转化浓度为100g/l(●)，150g/l(■)和200g/l(◆)。具体实施方法以下结合实施实例对本专利技术做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于以羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第145位、第205位的氨基酸进行突变或其任意组合得到的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于以羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，将第145位、第205位的氨基酸进行突变或其任意组合得到的突变体。2.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶的第145位的组氨酸突变为亮氨酸。3.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶的第145位的组氨酸突变为丙氨酸。4.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶的第205位的亮氨酸突变为甲硫氨酸。5.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶的第205位的亮氨酸突变为苏氨酸。6.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶的第205位的亮氨酸突变为谷氨酰胺。7.权利要求1所述的羰基还原酶ChKRED20突变体，其特征在于将该酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴中柳，赵凤佼，刘艳，裴小琼，郭超，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51