本发明专利技术提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD‑M01及其表达载体和应用。本发明专利技术以根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性进行过优化的葡萄糖氧化酶为基础，使用易错PCR 方法对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法挑选出正突变，获得了酶活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD‑M01，与原始基因产生的酶活相比，其酶活提高了47%，从而有利于实现其在工业化生产中降低生产成本的目的，本发明专利技术所提供的葡萄糖氧化酶突变体GOD‑M01具有良好的市场应用前景和工业价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01及其表达载体和应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, E.C.1.1.3.4, GOD） 有氧条件下能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，在工业领域具有重要的应用价值，目前已经在食品工业、畜牧养殖和医疗检测等领域中得到广泛应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，微生物是其主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。产自特异青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶已被列入农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》第4大类酶制剂。随着葡萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，其中葡萄糖氧化酶的催化效率决定了其应用成本，只有具有较高的酶活的葡萄糖氧化酶才能有效控制成本，从而适应大规模工业化生产的要求，实现产品市场化和商业化。筛选高酶活的天然葡萄糖氧化酶是一条重要途径，而使用蛋白质工程手段对天然葡萄糖氧化酶的人工改造也越来越广泛地被应用。易错PCR(error-prone PCR)技术是在利用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件（如提高酶离子浓度，改变体系中4种dNTP的浓度等)，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。为了获得更好的突变效果，可以使用连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的正突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01及其表达载体和应用。本专利技术通过对来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，使用易错PCR 方法对葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，获得了突变体蛋白，与野生型相比，突变体GOD-M01的酶活性得到显著提高。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD-M01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸获得。本专利技术还提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01的葡萄糖氧化酶编码基因。进一步的，所述的葡萄糖氧化酶编码基因具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组表达载体。进一步的，所述重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K- GOD-M01。本专利技术还提供了含有所述的重组表达载体的重组菌株。进一步的，所述重组菌株为重组毕赤酵母。本专利技术还提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01在用于制备动物饲料添加剂中的应用。进一步的：将所述的葡萄糖氧化酶编码基因与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主细胞中，获得重组宿主菌株，培养重组宿主菌株并诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，获得葡萄糖氧化酶。进一步的：所述宿主细胞为毕赤酵母。本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术首先合成了葡萄糖氧化酶GOD-1 全基因序列，同时根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性对其DNA 序列进行优化获得优化的基因，并采用易错PCR 方法对其进行随机突变，以pET 28a(+) 载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主中，挑选单克隆表达蛋白，同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照。离心重悬后，取部分菌液测定酶活性。活性高于对照的菌株转接到新的培养板中，进行重复筛选。将筛选得到的酶活性高于对照的菌株，送基因测序公司测序，获得突变体GOD-M01的DNA 序列。获得的酶活提高的突变体GOD-M01，与原始基因产生的酶活相比，其酶活提高了47%，从而有利于实现其在工业化生产中降低生产成本的目的，本专利技术所提供的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01具有良好的市场应用前景和工业价值。附图说明图1为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01与野生型氨基酸序列比较结果；图2为葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01与野生型的酶活比较测定结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。以下结合实施实例对本专利技术做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术范围的限制。实施例1：易错PCR(error–prone PCR) 方法构建葡萄糖氧化酶GOD-1 突变文库来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶GOD-1 由589个氨基酸组成（见SEQ ID NO：1）。为迅速得到GOD-1 全基因序列以利于对GOD-1 酶分子的改造，根据已报道的GOD-1 基因序列信息，采用全基因合成方法合成了葡萄糖氧化酶GOD-1 全基因序列（如Genbank ID KJ774107.1所示），合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点。同时根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性对其DNA 序列进行优化获得优化后的葡萄糖氧化酶基因GOD-1( 见SEQ ID NO：2)，采用以优化后的GOD-1为模板扩增葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1 基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）随机引入突变。所用引物为：5′-GCGCGAATTCTTGCCACATTACATTAGATCCAACGGTAT -3′（SEQ ID No:5），5′-TAAAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATCTTCCAAAATAGC-3′（SEQ ID No:6）；下划线处分别为EcoR I 和Not I酶切位点。反应条件为：94°C 预变性10min，94°C 变性60s，58°C 退火60s 和72° C 延伸2min，共30个循环，1% 琼脂糖电泳，试剂盒回收目的基因片段。将目的片段用EcoR I 和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a(+) 载体（氨苄抗性基因）用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3，涂布含有氨苄青霉素的LB 平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板，每孔中含有150uL LB培养基（含有1mM IPTG，50ng/mL氨苄青霉素），同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照，30℃ 220rpm震荡培养12h，将孔板置于-20℃，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。取出5uL粗酶液至新的96孔板，加入含有邻联茴香胺甲醇缓冲液、葡萄糖缓冲液、辣根过氧化物酶溶液的显色液共145uL，37℃反应3min后加入100uL2M硫酸终止反应，根据显色反应测定酶活。取酶活力比野生型GOD-1 高的菌株到新的96 孔培养板中，进行重复筛选。筛选到其中一个突变体为GOD-M01，酶活力是野生型对照的1-2倍，挑取单克隆送基因测序公司测序。测序结果显示，如图1所示，本轮易错PCR获得了一个含T173V单点突变的突变体GOD-M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD‑M01，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD‑M01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD‑M01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸获得。
【技术特征摘要】
1.一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD-M01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸获得。2.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-M01的葡萄糖氧化酶编码基因。3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因，其特征在于其具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K- GOD-M0...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，张稳，
申请(专利权)人：青岛红樱桃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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