高稳定性的人胰蛋白酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及高稳定性的人胰蛋白酶突变体。本发明专利技术人发现人阴离子胰蛋白的一些位点与其对热或pH值的稳定性相关，所述位点是第121位或第122位，在此基础上获得了一类人阴离子胰蛋白突变体，与野生型相比，所述突变体具有较高的稳定性。并且，在前述突变基础上结合人阴离子胰蛋白的第139位和206位的双突变，使得酶的稳定性和酶活性更为理想。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及高稳定性的人胰蛋白酶突变体。
技术介绍
自从体外重组技术自70年代成熟应用至今，大量的体内蛋白被重组克隆。重组蛋白相比于从动物体内提取的蛋白，有几大明显的优势：首先不涉及动物来源，无动物源性生产过程；其次，背景清楚，纯度高，适合重组药物生产，无血清培养等。胰蛋白酶在临床的肿瘤免疫治疗，组织培养、人用疫苗的生产等过程均不可缺少，现用胰蛋白酶为动物源性，有病毒污染的可能性，从而导致人蓄共患病的传播，采用无动物源性的重组胰蛋白酶是解决这一问题的根本方案。在2014年，美国药典对于应用于生物制药过程中的重组胰蛋白酶，给出了重组胰蛋白酶最新的检测标准。在皮肤组织细胞培养过程中，无动物源性的产品越来越受到的青睐。Went等人分别用提取的动物源性的胰蛋白酶和重组胰蛋白酶消化表皮层中的角质层细胞。表明重组胰蛋白酶消化后皮肤组织细胞的生长情况要明显优于动物源性胰酶处理后的细胞。综上，本领域需要大规模生产人来源的胰蛋白酶。但是天然的人胰蛋白酶酶的活性低、稳定性差，大大限制了其推广应用。因此，本领域迫切需要找到提高其稳定性的有效手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高稳定性的人胰蛋白酶突变体。在本专利技术的第一方面，提供人阴离子胰蛋白酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:1，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys。在一个优选例中，所述突变体的氨基酸序列还包括：对应于SEQIDNO:1，第206位由Ser突变为Cys；或第122位由Arg突变为Leu；并且，所述的突变体不是氨基酸序列如SEQIDNO:1氨基酸序列且第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys的突变体。在另一优选例中，所述突变体是：如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys、第121位由Ser突变为Ala第122位由Arg突变为Leu(简称S139C-S206C-S121A-R122L)；或如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第122位由Arg突变为Leu(简称S139C-S206C-R122L)；或如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第121位由Ser突变为Ala(简称S139C-S206C-S121A)；或如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第121位由Ser突变为Ala和第122位由Arg突变为Leu(简称S121A-R122L)。在另一优选例中，S139C-S206C-S121A-R122L在pH3-11，25℃保存2h，酶的活力均保持在80％以上；pH3，60℃保存12h残余酶活仍可保持在70％以上；其高温耐受性及pH耐受性极佳。在本专利技术的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种生产所述的人阴离子胰蛋白酶的突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。在本专利技术的另一方面，提供所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质，或用于细胞培养过程。在本专利技术的另一方面，提供一种提高重组的人阴离子胰蛋白酶稳定性的方法，所述方法包括：将人阴离子胰蛋白酶的第121位由Ser突变为Ala和/或第122位由Arg突变为Leu。在一个优选例中，还包括将人阴离子胰蛋白酶的第139位由Ser突变为Cys和/或第206位由Ser突变为Cys。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、四种胰蛋白酶的一级序列比对。ht1为人阳离子型胰蛋白酶；ht2为人阴离子型胰蛋白酶；bt1为牛胰蛋白酶(SEQIDNO:3)；pt1为猪胰蛋白酶(SEQIDNO:4)。图2、mhTg2-S139C-S206C蛋白电泳表达鉴定(a，b)及Westernblot结果(c)。mhTg2表示突变型人阴离子胰蛋白酶。(a-b)S139C-S206C蛋白电泳表达鉴定结果；(a)中，lane1、3、5：S139C-S206C-JM109(DE3)诱导前；lane2、4、6：S139C-S206C-JM109(DE3)诱导后；lane7、9、11：S139C-S206C-Rosetta(DE3)诱导前；lane8、10、12：S139C-S206C-Rosetta(DE3)诱导后；(b)中，lane1、3：37℃上清；lane2、4：37℃沉淀；lane5：25℃上清；lane6：25℃沉淀；lane7：15℃上清；lane8：15℃沉淀。(c)S139C-S206CWesternblot作用结果；lane9、12：诱导后；lane10、13：上清；lane11、14沉淀；M：Maker。图3、S139C、S139C-S206C-R122L表达鉴定结果。lane1：S139C，诱导前；lane2-4：S139C诱导后；lane5：S139C-S206C-R122L诱导前；lane6-12S139C-S206C-R122L诱导后；M:Marker。图4、S139C及S139C-S206C-R122L的洗脱曲线及电泳图。(a)S139C的洗脱曲线。(b)S139C-S206C-R122L的洗脱曲线。(c)S139C和S139C-S206C-R122L的纯化电泳图，lane1：S139C纯化电泳图；lane2：S139C-S206C-R122L纯化电泳图；M：Maker。图5、S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S121A、S139C-S206C-S121A-R122L表达鉴定结果。(a)lane1：S139C-S206C-S121A诱导前；lane2-4：S139C-S206C-S121A诱导后；lane5：S121A-R122L诱导后；lane6-12S139C-S206C-S121A-R122L诱导后；M：Maker；(b)lane1：S121A诱导前；lane2-9：S121A诱导后；M:Maker。图6、洗脱曲线及纯化鉴定。S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L、S121A-R122L和S121A的纯化电泳图：lane1：S139C-S206C-S121A；lane2：S139C-S206C-S121A-R122L；lane3：S121A-R122L；lane4：S121A；(b)S139C-S206C-S121A洗脱曲线；(c)S139C-S206C-S121A-R122L洗脱曲线；(d)S121A-R122L洗脱曲线；(e)S121A洗脱曲线。图7、S139C和S139C-S206C-R122L的pH稳定性。图8、S121A、S139C-本文档来自技高网...

【技术保护点】
人阴离子胰蛋白酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys。

【技术特征摘要】
1.人阴离子胰蛋白酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:1，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列还包括：对应于SEQIDNO:1，第206位由Ser突变为Cys；或第122位由Arg突变为Leu；并且，所述的突变体不是氨基酸序列如SEQIDNO:1氨基酸序列且第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys的突变体。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是：如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys、第121位由Ser突变为Ala第122位由Arg突变为Leu；或如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第122位由Arg突变为Leu；或如SEQIDNO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第121位由Ser突变为Ala；或如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵致，安少朋，
申请(专利权)人：上海雅心生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31