【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，更具体地，本专利技术涉及水解活性提高的胶原酶及其应用。
技术介绍
1、蛋白酶是一类能催化蛋白质肽键的断裂并将其降解成多肽、寡肽或氨基酸的水解酶，目前在全球的各个领域中均有着广泛的应用，约占全球酶行业交易总量的60％。
2、胶原蛋白的氨基酸组分中脯氨酸的高含量、特定的氨基酸序列以及刚性的三重螺旋和纤维的独特结构，使其在生理条件下能抵抗大多数蛋白酶的水解。将在生理ph、温度和盐浓度条件下，能够作用于天然胶原蛋白的螺旋区域，并将其降解成多肽，寡肽或氨基酸的蛋白酶称为胶原酶。目前对胶原酶的定义和分类还存在争议，其中最主要的原因是底物胶原蛋白的复杂性(胶原蛋白存在螺旋区和非螺旋区，以及天然胶原蛋白中或多或少的存在明胶和胶原多肽等)。与天然胶原蛋白相比，胶原多肽和明胶等小分子底物虽然含有gly-x-y三联体序列但是缺乏三重螺旋的刚性结构，一般将能水解胶原蛋白、胶原多肽或明胶等具有典型gly-x-y三联体序列底物的蛋白酶称为广义的胶原酶，而将能作用于天然胶原蛋白三重螺旋区域的蛋白酶称为真胶原酶，在本专利技术中胶原酶这个术语等同于真胶原酶。
3、胶原酶的研究始于十九世纪末，从梭状芽孢杆菌分离出一种具有水解胶原蛋白的胞外酶的研究报道之后，陆续鉴定和表征了许多来源于细菌和哺乳动物的其它胶原酶。目前人们已在多种生物中发现胶原酶的存在，如动物、植物和微生物，但是它们的底物特性各不相同。真核生物来源的胶原酶活性具有非常特殊的识别位点，而微生物胶原酶具有广泛的特异性，所以与动物胶原酶相比，微生物胶原酶具有更
4、微生物胶原酶主要包括m9家族的金属蛋白酶和少数来自s1、s8和s53家族的丝氨酸蛋白酶，除此之外，u32家族的一些成员也被报道具有水解天然胶原蛋白的能力。m9家族成员金属胶原酶包含一个保守的锌结合基序(hey/fth)或(heyt/vh)作为催化残基，s1家族、s8家族和s53家族分别以his-asp-ser、asp-his-ser和glu-asp-ser作为其催化残基，而u32家族有许多未知催化类型的胶原酶。此外，虽然对微生物胶原酶的研究较早，但目前仍知之甚少。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供水解活性提高的胶原酶及其应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种改造胶原酶、提高胶原酶水解活性的方法，包括：将胶原酶结构域与pkd-cbd1-cbd2结构域相互连接。
3、在一种或多种实施方式中，所述胶原酶结构域的氨基酸序列如seq id no:1中第1～677位所示。
4、在一种或多种实施方式中，所述pkd结构域的氨基酸序列如seq id no:1中第678-773位所示。
5、在一种或多种实施方式中，所述cbd1结构域的氨基酸序列如seq id no:1中第777-894位所示。
6、在一种或多种实施方式中，所述cbd2结构域的氨基酸序列如seq id no:1中第899-1009位所示。
7、在一种或多种实施方式中，改造的酶蛋白从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域，pkd-cbd1-cbd2结构域。
8、在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白中，所述胶原酶结构域、所述pkd-cbd1-cbd2结构域通过肽键连接。
9、在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白的kcat/km高于45min*mmol/l；较佳地高于50min*mmol/l；更佳地高于55min*mmol/l；更佳地高于60min*mmol/l。
10、在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白的km值低于0.35mmol/l；较佳地低于0.3mmol/l；更佳地低于0.28mmol/l。
11、在本专利技术的另一方面，提供一种经改造的酶蛋白，所述酶蛋白由相互连接的以下的蛋白片段形成：胶原酶结构域，pkd-cbd1-cbd2结构域。
12、在本专利技术的另一方面，提供所述的经改造的酶蛋白的用途，用于：降解含有胶原酶水解位点的蛋白。
13、在本专利技术的另一方面，提供制备降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物。
14、在一种或多种实施方式中，所述含有胶原酶水解位点的蛋白为胶原蛋白(包括含有胶原酶水解位点的胶原蛋白类似物)。
15、在本专利技术的另一方面，提供一种核酸分子或含有该核酸分子的重组载体，所述的核酸分子编码所述的经改造的酶蛋白。
16、在一种或多种实施方式中，所述的载体以pet28a为骨架载体。
17、在本专利技术的另一方面，提供一种基因工程细胞，所述细胞含有所述的重组载体或其基因组中整合有所述的核酸分子。
18、在一种或多种实施方式中，所述细胞为原核细胞。
19、在一种或多种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌细胞。
20、在本专利技术的另一方面，提供一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物，所述的组合物含有：(i)所述的经改造的酶蛋白；和(ii)生物学上可接受的载体。
21、在本专利技术的另一方面，提供一种降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法，包括：以所述的经改造的酶蛋白或所述的组合物处理所述含有胶原酶水解位点的蛋白或包含其的对象。
22、在一种或多种实施方式中，所述胶原酶水解位点包括胶原蛋白三重螺旋区域。
23、在一种或多种实施方式中，所述降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法中，所述经改造的酶蛋白通过作用于胶原蛋白三重螺旋区域，降解含有胶原酶水解位点的蛋白。
24、在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系的温度为0～70℃；较佳地为5～65℃或10～65℃(如为15～65℃，更具体地如20、22、25、28、30、35、40、45、50、55、60、62℃)。
25、在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系的ph值范围3～13；较佳地ph值范围为4～12或4～11(如为4.5～11，更具体地如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5)。
26、在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系中，添加co2+以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含pz肽(4-苯基偶氮苄氧基羰基-pro-leu-gly-pro-d-arg)；较佳地，co2+在体系中的终浓度为1～5mm。
27、在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系中，添加ca2+、mg2+或co2+以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含明胶或胶原蛋白；较佳地，ca2+在体系中的终浓度为1～10mm；较佳地，mg2+在体系中的终浓度为1～10mm；较佳地，co2+在体系中的终浓度为1～10mm(更佳地，ca2+在体系中的终浓度为1～5mm；较佳地，mg2+在体系中的终浓度为1～5mm；较佳地，co2+在体系中的终浓度为1～5mm)。
28、在本专利技术的另一方面，提供一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的试剂盒，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改造胶原酶、提高胶原酶水解活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域相互连接；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改造的酶蛋白从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域；或
3.一种经改造的酶蛋白，其特征在于，所述酶蛋白由相互连接的以下的蛋白片段形成：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域；
4.权利要求1所述的经改造的酶蛋白的用途，用于：
5.一种核酸分子或含有该核酸分子的重组载体，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求3所述的经改造的酶蛋白。
6.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的重组载体或其基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：
8.一种降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求3所述的经改造的酶蛋白或权利要求7所述的组合物处理所述含有胶原酶水解位点的蛋白或包含
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进行所述降解时，
10.一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求3所述的经改造的酶蛋白；
...【技术特征摘要】
1.一种改造胶原酶、提高胶原酶水解活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将胶原酶结构域与pkd-cbd1-cbd2结构域相互连接；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改造的酶蛋白从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域，pkd-cbd1-cbd2结构域；或
3.一种经改造的酶蛋白，其特征在于，所述酶蛋白由相互连接的以下的蛋白片段形成：胶原酶结构域，pkd-cbd1-cbd2结构域；
4.权利要求1所述的经改造的酶蛋白的用途，用于：
5.一种核酸分子或含有该核酸分子的重组载体，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求3所述的经改造的酶蛋白。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓，赵季祥，
申请(专利权)人：上海雅心生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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