一种耐盐的RPK突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种耐盐的RPK突变体及其应用。本发明专利技术人发现蛋白酶K的一些位点与其耐盐性及稳定性密切相关，在此基础上开发了一种蛋白酶K突变体，与野生型相比，所述突变体的耐盐性及稳定性更好。本发明专利技术也提供了优化的表达重组蛋白酶K突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。适合规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种耐盐的RPK突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种耐盐的RPK突变体及其应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶K(PK)是一种非特异性蛋白内切酶，该酶属丝氨酸类蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸羧基端连接的酯键和肽键。分子量大小为29.3kDa(单体)，在pH4到pH12的条件下均有活性，在SDS、尿素或EDTA存在时亦很稳定。
[0003]蛋白酶K能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。此酶经脱色和色谱纯化去除了RNA和DNA，也检测不到其它杂酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，其水解的最小多肽是四肽分子。
[0004]然而，本专利技术人在发酵生产中发现，重组蛋白酶K(RPK)易发生聚集沉淀的问题，给实际生产过程带来问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种耐盐的RPK突变体及其应用。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种蛋白酶K突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的蛋白酶K，以下位点发生突变的酶：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。
[0007]在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶K突变体的第266位突变为Tyr、第279位突变为Gly。
[0008]在一个或多个实施方式中，所述的蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]在本专利技术的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码前一方面所述的蛋白酶K突变体。
[0010]在一个或多个实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011]在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的的多核苷酸。
[0013]在一个或多个实施方式中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
[0014]在一个或多个实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。
[0015]在一个或多个实施方式中，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。
[0016]在本专利技术的另一方面，提供一种提高蛋白酶K的耐盐性或稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于SEQ ID NO:1所示的蛋白酶K，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。
[0017]在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶K突变体的制备方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的蛋白酶K突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的蛋白酶K突变体。
[0018]在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的蛋白酶K突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于酶解蛋白质；较佳地，其被用于特异性识别和切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，酶解蛋白质。
[0019]在本专利技术的另一方面，提供一种酶解蛋白质的方法，包括：利用前面任一所述的蛋白酶K突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行酶解反应。
[0020]在本专利技术的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：前面任一所述的蛋白酶K突变体，表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物。
[0021]本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0022]图1、野生型RPK和RPK突变体突变体的三维结构对比。
[0023]图2、野生型RPK和RPK突变体分子表面疏水图。
[0024]图3、野生型RPK和RPK突变体原液稳定性对比。
具体实施方式
[0025]本专利技术人经过深入的研究试验，发现蛋白酶K的一些位点与其耐盐性及稳定性密切相关。在此基础上，本专利技术人获得了一种蛋白酶K突变体，与野生型相比，所述突变体的耐盐性及稳定性更好。本专利技术也提供了优化的表达重组蛋白酶K突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。
[0026]术语
[0027]如本文所用，除非另外说明，所述的“蛋白酶K的突变体”、“突变型蛋白酶K”可互换使用，是指对应于野生型蛋白酶K(如SEQ ID NO:1)，发生选自以下位置的突变后所构成的蛋白：第266位、第279位。
[0028]如本文所用，除非另外说明，所述的“蛋白酶K的突变体”、“突变型蛋白酶K”可互换使用，是指对野生型的蛋白酶K进行突变后的产物。
[0029]如本文所用，若需要表示野生型的蛋白酶K，其将被标示为“野生型蛋白酶K”、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或WT。
[0030]如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0031]如本文所用，“分离的蛋白酶K突变体”是指蛋白酶K突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化蛋白酶K突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
[0032]如本文所用，“重组的(Recombinant；R)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制
备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
[0033]如本文所用，“提高耐盐性或稳定性”是指与改造前的野生型蛋白酶K相比，发生突变的蛋白酶K的耐盐性或稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，耐盐性或稳定性提高的突变型蛋白酶K的耐盐性或稳定性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。
[0034]如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”。术语“基本上由
……
构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
[0035]如本文所用，术语“有效量”是指可对本专利技术感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。
[0036]蛋白酶K突变体、其编码核酸及构建体
[0037]本专利技术的蛋白酶K突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
[0038]本专利技术还包括所述蛋白酶K突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶K突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的蛋白酶K，以下位点发生突变的酶：第266位、第279位；所述位点突变为亲水性或中性氨基酸。2.如权利要求1所述的蛋白酶K突变体，其特征在于，第266位突变为Tyr、第279位突变为Gly；较佳地，所述的蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.分离的多核苷酸，其编码权利要求1～2任一所述的蛋白酶K突变体。4.一种载体，它含有权利要求3所述的多核苷酸。5.一种遗传工程化的宿主细胞，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求3所述的的多核苷酸；较佳地，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。6.一种提高蛋白酶K的耐盐性或稳定性的方法，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书九页序列表四页附图二页，
申请(专利权)人：上海雅心生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：