一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法技术

本发明专利技术提供一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术的SUMO蛋白酶的生产方法，包括：1)构建SUMO蛋白酶表达载体；2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶。本发明专利技术的SUMO蛋白酶表达载体的表达量高，SUMO蛋白酶的提取方法简便，适合工业化大规模生产；特别是，本发明专利技术方法生产的SUMO蛋白酶的活性高，在用于切割去除融合标签以获得目的蛋白等方面具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种SUMO蛋白酶的生产方法。

技术介绍

[0002]SUMO蛋白酶是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，来源于酵母编码的MIP1基因，能够特异性识别UBL蛋白的三级结构SUMO(Small Ubiquitin
‑
Like Modifier)，并依赖正确的蛋白质构象；即，在仅有完整序列而没有正确结构时，SUMO蛋白酶是不能对目标蛋白进行切割的。SUMO蛋白酶是目前切割特异性最好的蛋白酶，可在较广泛的作用温度和PH范围(pH7
‑
9)内发挥作用。
[0003]由于靶蛋白可以通过与类泛素蛋白(sumo)进行融合表达，以提高靶蛋白的可溶性；因此，高活性的SUMO蛋白酶可用于切割去除融合标签获得目的蛋白。目前，市场上SUMO蛋白酶的生物活性普遍较低，此外常规的的SUMO蛋白酶生产方法通常步骤繁琐，且成本较高。因此，提高SUMO蛋白酶的表达量及活性，同时减少生产成本，是非常有必要的。
[0004]公开号为CN 108774634 A的中国专利申请公开了一种重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET
‑
21b
‑
SUMO蛋白酶表达质粒的构建；S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。该方法应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现了重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的表达。然而，该方法SUMO蛋白酶的表达量及活性提高程度有限，无法适应工业化大规模生产。
[0005]鉴于此，特提出了本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，利用该方法生产SUMO蛋白酶时，SUMO蛋白酶的表达量以及活性显著提高。
[0007]本专利技术提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，按照下述步骤进行：
[0008]1)构建SUMO蛋白酶表达载体；
[0009]2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；
[0010]3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶。
[0011]步骤1)中，所述SUMO蛋白酶表达载体为pET30a
‑
stag
‑
Bsulpstar。
[0012]步骤2)中，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0013]进一步地，步骤2)包括：
[0014]将质粒pET30a
‑
stag
‑
Bsulpstar与感受态细胞混匀，随后进行冰浴、水浴热击、冰浴，再于培养基中进行复苏培养；
[0015]将复苏培养后的培养液涂布于含有卡那青霉素和氯霉素的固体培养基中进行培养，培养后挑取单克隆并筛选阳性转化子，获得基因工程菌。
[0016]已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为
CGMCC No.22263，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
[0017]进一步地，所述固体培养基中卡那青霉素的浓度为45
‑
55μg/mL，氯霉素的浓度为30
‑
40μg/mL。
[0018]在本专利技术的步骤3)中，采用发酵培养基进行培养，其中每升发酵培养基中含有蛋白胨18
‑
22g，酵母提取物8
‑
12g，Na2HPO4·
7H2O 6
‑
7g，KH2PO
4 3
‑
4g，NH4Cl 2
‑
3g，Na2SO
4 0.5
‑
1.0g，MgSO
4 0.4
‑
0.6g，甘油4
‑
6mL，葡萄糖0.4
‑
0.6g，乳糖1.8
‑
2.2g，FeCl
3 0.001
‑
0.005g。
[0019]进一步地，步骤3)中，所述培养的条件如下：接种量为0.5
‑
1.5％，培养温度为28
‑
32℃，搅拌速度200
‑
240rpm，培养时间为18
‑
22h。
[0020]在本专利技术的步骤3)中，从培养液中提取SUMO蛋白酶包括：
[0021]从培养液中收集菌体，将菌体悬于裂解缓冲液中，于冰浴中超声裂解细胞；其中，超声裂解细胞的条件如下：功率为25％，超声2
‑
3秒后停3
‑
5秒作为一个循环，共进行340
‑
360个循环；
[0022]对裂解液进行离心，采用微孔滤膜对离心上清液进行过滤，得到粗酶液。
[0023]进一步地，本专利技术的SUMO蛋白酶的生产方法，还包括对所述粗酶液进行提纯。
[0024]具体地，所述提纯包括：
[0025]采用镍柱对所述粗酶液进行柱层析；
[0026]对所述柱层析的流出液进行透析。
[0027]本专利技术的实施，至少具有以下优势：
[0028]1、本专利技术的SUMO蛋白酶表达载体pET30a
‑
stag
‑
Bsulpstar，通过优化启动子和信号肽，可以在枯草芽孢杆菌中大量产生具有高活性的SUMO蛋白酶，从而大大降低了SUMO蛋白酶的生产成本。
[0029]2、本专利技术采用枯草芽孢杆菌表达系统进行表达，具有培养条件易于控制、繁殖速度快、分泌量高、SUMO蛋白酶提取工艺操作相对简单等优点，特别适用于大规模的生产。
[0030]3、本专利技术的方法生产成本低、并且易于操作，其分泌得到的SUMO蛋白酶浓度高、生物活性强，整个工艺过程无毒害物质产生，在用于切割去除融合标签以获得目的蛋白等方面具有良好的应用前景。
附图说明
[0031]图1为本专利技术枯草芽孢杆菌的菌落形态。
[0032]图2为本专利技术枯草芽孢杆菌革兰氏染色图。
[0033]图3为本专利技术枯草芽孢杆菌基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的附图和实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]实验材料及试剂如下：
[0036]一、实验材料
[0037]Tryptone、Yeast Extract：Oxoid公司原装产品；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SUMO蛋白酶的生产方法，其特征在于按照下述步骤进行：1)构建SUMO蛋白酶表达载体；2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶；步骤1)中，所述SUMO蛋白酶表达载体为pET30a
‑
stag
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Bsulpstar；步骤2)中，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；进一步地，步骤2)包括：将质粒pET30a
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stag
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Bsulpstar与感受态细胞混匀，随后进行冰浴、水浴热击、冰浴，再于培养基中进行复苏培养；将复苏培养后的培养液涂布于含有卡那青霉素和氯霉素的固体培养基中进行培养，培养后挑取单克隆并筛选阳性转化子，获得基因工程菌。2.根据权利要求1所述的一种SUMO蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述固体培养基中卡那青霉素的浓度为45
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55μg/mL，氯霉素的浓度为30
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40μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种SUMO蛋白酶的生产方法，其特征在于，步骤3)中，采用发酵培养基进行培养，其中每升发酵培养基中含有蛋白胨18
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22g，酵母提取物8
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12g，Na2HPO4·
7H2O 6
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7g，KH2PO
4 3
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4g，NH4Cl 2
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3g，Na2SO<...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪斌，蔡玥，常婧洋，黄小星，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：