一种胰蛋白酶制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胰蛋白酶制备方法，即利用Psumo3‑AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸，过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体，然后将包涵体清洗、溶解和复性，最后将胰蛋白酶激活和纯化。本发明专利技术的优点在于：(1)利用基因工程原理，利用大肠杆菌表达重组的胰蛋白酶，原料来源明确，蛋白质量可控；(2)采用Sumo3融合蛋白形式，经特异性高的Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切除Sumo3标签得到有生物活性的胰蛋白酶，本方法中胰蛋白酶的激活速率可控，折叠效率高且所得蛋白均一性好。

【技术实现步骤摘要】
一种胰蛋白酶制备方法
本专利技术属于生物领域，更具体地讲，涉及一种胰蛋白酶制备方法。
技术介绍
胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一种应用广泛的蛋白水解酶，通过识别精氨酸或者赖氨酸等侧链上的正电荷，特异性水解其羧基端的肽键，是一种肽链内切酶。根据带点性质的不同可分为阳离子型胰蛋白酶，阴离子型胰蛋白酶，中性胰蛋白酶。胰蛋白酶主要用于糜蛋白酶原，羧肽酶原等的激活。Orsolyakiraly等开始在大肠杆菌中表达人阳离子型胰蛋白酶原，Vasquez等人利用pho前导序列在大肠杆菌周质中表达了具有活性的小鼠胰蛋白酶，但是产量很低，Buswell等人通过该方法复性了重组的牛胰蛋白酶取得了较好的效果，提高了复性率。另外HubertusHohenblum等人也通过相似的方法成功地复性了重组人胰蛋白酶原。现有方法中，胰蛋白酶的来源是动物脏器提取，胰蛋白酶原的激活方式是胰蛋白酶的自我激活，这些方法要么是有潜在的被污染的可能，要么是激活方式不可控。另外，现有方法胰蛋白酶产量较低，均一性有待提高。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种能够人为可控的激活胰蛋白酶和提高胰蛋白酶均一性的胰蛋白酶制备方法。为实现以上目的，本专利技术公开以下技术方案：一种胰蛋白酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胰蛋白酶表达载体的克隆构建：利用Psumo3-AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸；(2)过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体；(3)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的清洗、溶解；(4)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的复性：复性液的组分为1.5-2.5M尿素(Urea)，30-100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)PH8.5,10-20mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，1-5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)；(5)胰蛋白酶的激活和纯化：充分复性后，经阳离子交换层析纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3-trypsin，经过Sumo特异性蛋白酶2切去Sumo3标签蛋白，经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶。作为一个优选方案，所述复性液还包括10-50mM氯化钙。作为一个优选方案，所述复性液的组分为2M尿素，50mM三羟甲基氨基甲烷PH8.5，15mM还原型谷胱甘肽或者半胱氨酸，1mM氧化型谷胱甘肽或者胱氨酸，50mM氯化钙。作为一个优选方案，所述胰蛋白酶种属来源为人源、猪源、牛源或鼠源。作为一个优选方案，所述连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸是指连接胰蛋白酶氨基酸序列第24位到最后一位氨基酸的野生型全长形式，或者第24位到最后一位氨基酸之前的任意截短形式，以及全长形式和截短形式对应的氨基酸任意突变形式。Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸是指取Sumo3标签蛋白1-92位氨基酸与胰蛋白酶的第24位至最后一位或保留胰蛋白酶活性的最后一位氨基酸连接。比如取Sumo3标签蛋白1-92位氨基酸与人源胰蛋白酶的第24-247位氨基酸的连接。本文所述Sumo3标签蛋白，胰蛋白酶氨基酸的编号方式参考Uniport，本文使用的Sumo3标签蛋白基于Uniport中氨基酸序列稍作改变，本文使用的胰蛋白酶均指阳离子型胰蛋白酶。将克隆完成的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)等菌株中，培养细菌，在OD600为0.8-1时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导过表达形成包涵体蛋白。破碎细菌，提取胰蛋白酶融合蛋白包涵体。在依次经过缓冲液A(10mMTrispH7.4，150mMNacl，1％Triton-X100,10mMEDTA)，缓冲液B(10mMTrispH7.4，150mMNacl，10mMEDTA)洗涤后，将包涵体溶解到8M盐酸胍，10mMDTT中，最后滴加到不断搅拌的复性液中复性。在4摄氏度静置24-48小时充分复性后，用1M冰醋酸将复性液的pH值调节到6，经阳离子交换层析法纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3-trypsin(胰蛋白酶),经过Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切去Sumo3标签蛋白。最后经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶。本专利技术的优点在于：(1)传统的胰蛋白酶的主要来源于动物脏器，缺点是原料成分复杂，易收到病毒等污染。本技术是利用基因工程原理，表达重组的胰蛋白酶，原料来源明确，蛋白质量可控；(2)现有的重组胰蛋白酶激活方法主要是胰蛋白酶原的自我激活，这种激活方式是一种级联放大反应，激活过程很难控制，本技术采用的是Sumo3融合蛋白的形式，经特异性高的Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切除Sumo3标签得到有生物活性的胰蛋白酶，本方法中胰蛋白酶的激活速率可控，折叠效率高且所得蛋白均一性好。附图说明图1是本专利技术的胰蛋白酶制备的总体流程图。图2是本专利技术的Sumo3标签蛋白与野生型人源胰蛋白酶连接方式示意图。图3是尿素浓度对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的复性效果影响示意图。图4a是本专利技术的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白阳离子交换层析峰谱图。图4b是本专利技术的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白阳离子交换层析蛋白质电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的克隆构建借助商业化的Psumo3-AMP载体克隆质粒，该DNA序列翻译形成的蛋白序列特征是：Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸(Sumo3标签蛋白1-92序列如SEQIDNO.1所示)，胰蛋白酶可以是不同种属来源的，比如常用的人源，猪源，牛源，鼠源等。胰蛋白酶氨基酸序列包括第24位到最后一位氨基酸的野生型全长形式，包括第24位到最后一位氨基酸之前的任意截短形式，以及全长形式和截短形式对应的氨基酸任意突变形式。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码野生型人源胰蛋白酶24-247位氨基酸(人源胰蛋白酶24-247位序列如SEQIDNO.2所示)的核苷酸序列，并在序列两段引入BamH1,Xho1限制性内切酶酶切位点。37℃中，将扩增的核苷酸片段和商业化的Psumo3-AMP载体用10个单位的高保真限制性内切酶酶BamH1-HF,Xho1-HF在37℃处理1小时。然后，利用T4DNA连接酶将编码野生型人源胰蛋白酶24-247位氨基酸的核苷酸序列插入到Psumo3-AMP载体上。最后，利用突变的方法删除载体上第411-413核苷酸序列，即得到用于表达的质粒DNA。SEQIDNO.1：MGHHHHHHGSLQEEKPKEGVKTENDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRFRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGG。SEQIDNO.2：IVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINALVSTISLPTAPPATGTKCLISGW本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰蛋白酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胰蛋白酶表达载体的克隆构建：利用Psumo3‑AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸；(2)过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体；(3)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的清洗、溶解；(4)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的复性：复性液的组分为1.5‑2.5M尿素，30‑100mM三羟甲基氨基甲烷PH 8.5，10‑20mM还原型谷胱甘肽或者半胱氨酸，1‑5mM氧化型谷胱甘肽或者胱氨酸；(5)胰蛋白酶的激活和纯化：充分复性后，经阳离子交换层析纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3‑trypsin，经过Sumo特异性蛋白酶2切去Sumo3标签蛋白，经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶。

【技术特征摘要】
1.一种胰蛋白酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胰蛋白酶表达载体的克隆构建：利用Psumo3-AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸；(2)过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体；(3)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的清洗、溶解；(4)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的复性：复性液的组分为1.5-2.5M尿素，30-100mM三羟甲基氨基甲烷PH8.5，10-20mM还原型谷胱甘肽或者半胱氨酸，1-5mM氧化型谷胱甘肽或者胱氨酸；(5)胰蛋白酶的激活和纯化：充分复性后，经阳离子交换层析纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3-trypsin，经过Sumo特异性蛋白酶2切去Sumo3标签蛋白，经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周爱武，张飞，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海,31