一种软骨素合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种软骨素合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将大肠杆菌K4来源的软骨素合酶在枯草芽孢杆菌中进行保守区域中非保守氨基酸的组合突变，获得了软骨素产量提高、分子量减小的突变体。同时，通过3L发酵罐放大发酵，实现了枯草芽孢杆菌高产低分子量的软骨素，3L罐上产物产量为7.25g/L，产物平均分子量为41.62kDa。本发明专利技术为食品级微生物高效生产制备软骨素奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种软骨素合酶突变体及其应用，属于生物工程

技术介绍
软骨素(chondroitin)为糖胺聚糖(GAG)的多糖家族。糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元组成的无支链的、带负电荷的多糖链，由于其独特的非柔性的性质和高的负电荷，GAG表现出高度延展的构象，占用大量空间，吸收阳离子和水并在细胞外基质中形成多孔的凝胶，在大多数动物中被发现的GAG帮助水合和扩展组织，并使基质能够承受压力(compressive force)。因此，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物。软骨素一种构为4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1(GlcUA：葡糖醛酸，GalNAc：乙酰半乳糖胺)二糖单体以β-1,3键交替连接而成的聚多糖。硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)，是软骨素糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。一般硫酸软骨素约含有50-70个双糖单位，分子量在10000-50000道尔顿之间。硫酸软骨素是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，具有多种药理作用与生理功能。研究发现硫酸软骨素具有抗动脉粥样硬化作用，镇痛抗炎作用，促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用，免疫调节作用，抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用，还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。随着对硫酸软骨素生理功能及生化性质的深入研究，在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为流行的保健品长期应，用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率，也做为膳食补充用于保护关节。尽管CS已有很多的药效，但小分子的CS药效更为显著。小分子的CS，以硫酸软骨素为主体构成的蛋白聚糖在软骨基质中起着一种“分子弹簧”的作用，具有止痛、促进软骨再生的功效，可从根本改善关节问题。且低分子量的CS，无论口服或者注射用，吸收效果均优于高分子量CS。硫酸软骨素主要存在于动物的软骨组织中，硫酸软骨素的工业化生产主要是采用酶法与碱法相结合等传统的提取工艺，从气管、鼻中隔、鸡龙骨及鲨鱼软骨等动物软组织中提取硫酸软骨素。传统的提取方法造成软骨素的收率低，成本较高，且碱解产生的大量工业废水易对环境产生较大影响。同时，原材料的短缺和下游纯化工艺的复杂程度限制了该活性成分的全球利用度，因此市场受限于不能满足不断增长的需求。而且，从长远来看，由于不断颁布对动物来源药物的安全性日益严格的管理条例，动物组织提取获得的硫酸软骨素可能将被限制在生药市场之外。为此，采用安全有效的方法制备硫酸软骨素已成为需要首要解决的问题。这就迫切需求人们开始寻求新的替代途径。自然界中许多真菌和细菌等微生物均能合成低聚合度的硫酸软骨素或其类似物，目前研究发现能产软骨素的微生物主要集中在巴斯德杆菌Pasteurellamultocida、大肠杆菌Escherichia coli K4。但作为工业生产菌株需具备：人畜安全；生长迅速，发酵周期短；遗传背景清楚；能大量合成硫酸软骨素或其类似物等条件。由于上述菌株都存在一定的致病性及大肠杆菌产内毒素及热源物质等，不能满足现在的食品医疗安全要求。因此本专利技术选用枯草芽孢杆菌这一食品级基因工程菌，具备上述条件。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种软骨素合酶突变体，所述突变体是：(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.2所示序列基础上，A236-P246区域的氨基酸序列突变为DILDCDMAPYA，D461-D473区域的氨基酸序列突变为DLEVCTSEDGSPD，I600-Y609区域的氨基酸序列由突变为MTNAVDYDVG；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有软骨素合酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有软骨素合酶活性的蛋白质。本专利技术的第二个目的是提供编码所述软骨素合酶突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的载体或细胞。本专利技术的第四个目的是提供获得所述软骨素合酶突变体的方法，所述方法对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶A236-P246，D461-D473，G516-E530和I600-Y609区域进行组合突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法通过对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶的所述区域中非保守氨基酸进行组合突变，并在枯草芽孢杆菌中异源表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括对软骨素产量提高，分子量降低的突变体的高通量筛选。本专利技术的第五个目的是提供一种重组表达所述软骨素合酶突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主，以诱导型启动子PxylA启动编码软骨素合酶突变体的基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是利用具有整合于Bacillus subtilis 168上lacA位点的上下游同源臂和红霉素抗性标记的pAX01为表达载体。本专利技术还提供了一种应用所述重组菌发酵生产软骨素的方法，是将重组菌接种至发酵培养基中，在37℃下培养54-80h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基以蔗糖作为碳源。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成成分为：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸钾3.9g/L，硫酸镁1.5g/L，50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0。本专利技术还提供了所述突变体及含有该突变体的细胞株系在生产软骨素中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌仅在基因组上整合表达SEQ ID NO.1所示合酶基因kfoC，并共表达SEQ ID NO.3所示半乳糖胺异构酶基因kfoA。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组上整合表达软骨素合酶基因突变体库VkfoC，并共表达半乳糖胺异构酶基因kfoA，筛选得到1株软骨素产量提高，分子量降低的突变株，其突变后合酶基因为VkfoC1。有益效果：本专利技术利用快速进化软骨素合酶在枯草芽孢杆菌中产软骨素，具有较大的应用优势。首先，本专利技术过程中使用的宿主为食品级，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险；其次，经分子改造后的软骨素合酶，合成软骨素的产量有较大幅度的提高，并获得了分子量降低的产物，通过3L罐放大发酵，可以获得进一步提高的软骨素产量，3L罐上产物产量为7.25g/L，产物平均分子量为41.62kDa。基于应用分析，本专利技术方法在工业上用于制备高产量、低分子的软骨素具有潜在而广泛的价值。附图说明图1所示为高通量筛选中获得的产量正向突变株的软骨素产量趋势；图2所示为摇瓶复筛中获得的1株产量提高、分子量减小的突变株B.subtilis VCH及野生菌株B.subtilis ECH的软骨素产量曲线；图3所示为3L罐上突变株B.subtilis VCH和野生菌株B.subtilis ECH的细胞生长曲线和软骨素产量曲线。具体实施方式软骨素发酵产物分子量检测分析方法：采用高效体积排阻色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种软骨素合酶突变体，其特征在于，是(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.2所示序列基础上，A236‑P246区域的氨基酸序列突变为DILDCDMAPYA，D461‑D473区域的氨基酸序列突变为DLEVCTSEDGSPD，I600‑Y609区域的氨基酸序列突变为MTNAVDYDVG；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有软骨素合酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有软骨素合酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种软骨素合酶突变体，其特征在于，是(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.2所示序列基础上，A236-P246区域的氨基酸序列突变为DILDCDMAPYA，D461-D473区域的氨基酸序列突变为DLEVCTSEDGSPD，I600-Y609区域的氨基酸序列突变为MTNAVDYDVG；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有软骨素合酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有软骨素合酶活性的蛋白质。2.编码权利要求1所述软骨素合酶突变体的基因。3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。4.一种获得权利要求1所述软骨素合酶突变体的方法，其特征在于，对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶A236-P246，D461-D473，G516-E530和I600-Y609区域进行组合突变。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶的所述区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，张琳培，周正雄，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32