本发明专利技术公开了一种精确定量控制肝素/类肝素中CS及DS含量的方法。该方法步骤如下：1)向含类肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，待DS含量达到预期值时，终止酶解反应；2)向溶液中继续加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，待CS含量达到预期值时，终止酶解反应，即得到期望CS及DS含量的肝素样品或类肝素样品。本发明专利技术实现了对肝素/类肝素中CS、DS含量的高效、精确控制，从而建立新型肝素类产品的低成本、高产率的生产工艺。且该方法简单易行，具有规模化生产的应用价值，能够用于生产符合欧洲药典标准的达那肝素钠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的 方法。
技术介绍
1. 1 肝素 1. 1. 1肝素简介： 肝素化巧arin，H巧首先从肝脏发现而得名，肝素广泛分布在哺乳动物的组织 中，如肝、肺、肠系膜、屯、、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在（高照明，曹现平，张 玉冰，猪小肠粘膜/浆膜/肠衣中的粘多糖组成分析，化学与生物工程，2012, 29(4); 91-94)。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝 素前体，当物理或化学剌激使肥大细胞脱粒时，肝素被释放出来，在体内被肝脏产生的肝素 酶灭活而从尿排泄出来炬rinkous K.M, Smith H.P, Warner E.D,et al. The Inhibit ion o f Blood Clotting:an Unidentified Sub-stance which Acts in Conjunction w it h Heparin to Prevent t he Conversion of Prothrombin into ThrombinlJ2. Am. J. Phy siol，1939, 125:683~687.)。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞 性疾病的首选药物。随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的 作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能烟larles H Best. Pr巧aration of Heparin and Its Use in the First Clinical Cases. Circulation. 1959, 19:79~ 86)。肝素在体内多W与蛋白质结合W糖蛋白复合物的形式存在。该种复合物没有抗凝血活 性，但在去除蛋白质后，该种抗凝活性逐渐表现出来OJader皿,Lopes C, Rocha Hao, Santos EA, Dietrich CP. Heparins and heparinoids occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activitie. Curr. pHarm. Des. 2004,10 ;951 ~966)。 由于疯牛病的病原体阮粒是传染性蛋白质颗粒，为不含有核酸的感染性蛋白因子，其主要 成份是一种蛋白酶抗性蛋白，具有对蛋白酶的抵抗力，易溶于去污剂、有致病力和不诱发抗 体等特性，给患病动物及人类的诊断和防治带来很大麻烦，给人类和动物的健康和生命带 来严重的威胁，因此从反当动物中提取肝素钢存在较大的安全性风险，现在药用肝素钢主 要从猪小肠黏膜提取化azuy址i Sug址ara, Satoml P'Jadanaka, Kyoko Takeda. Structural analysis of unsaturated hexasaccharides from shark cartilage chondroitin sulfate D that are substrates for the exolytic action of chondroitin sulfate ABC lyase. Elurope of journal biochemistry, 2006, 239:871-880)。 肝素钢的结构异常复杂，是由糖醒酸和葡萄糖胺W 1 - 4键连接起来的为主 要重复二糖单位组成的多糖链的混合物。其分子量是一个很宽的分布为3000-30000， 平均分子量是12000-15000,含10-30个二糖单位不等，约有4种糖醒酸和10种葡萄糖 胺交替无序排列组成（Rafael B. Erlich, Claudio C.Werneck, Paulo A.S.Mourao,et al.Major glycosaminoglycan species in the developing retina:synthesis tissue distribution and effects upon cell death.Expetimental eye research, 2003, 77:157-165)。肝素钢结构中的主要单糖是2-0-硫酸-a -L艾杜糖醒酸 及6-0-硫酸-N-硫酸-a -D葡萄糖胺，该两种糖单元是肝素钢结构中出现频率最高的 两个重复单元，由它们组成的=硫酸二糖的重复单位构成了肝素所谓的"规则区"，是肝 素结构的主要部分，也起到了肝素钢抗凝血的主要作用（Komazawa H，Saiki I，Igarashi Y, et al.The conjugation of RGDS p巧tide with CM-chitin(4):299-307.)。另外 的含有多种单糖残基，如a A-艾杜糖醒酸，葡萄糖醒酸，6-0-硫酸-N-己酷- a -D葡 萄糖胺，0 -D-葡萄糖醒酸及3-6-双-0-硫酸-N-硫酸- a -D葡萄糖胺则W很低的频 率出现于"非规则区"化irano S, Tanaka Y, Haseqawa M, et al.Effect of sulfated deriva tives of chitosan on some blood coagulant factors. Carbohydr Res, 1985, 137 (3) : 205-215.)。一定数目的6位无硫酸化的葡萄糖胺及2-0-硫酸-a -D葡 萄糖醒酸的存在使得肝素中出现了 10种不同的单糖（4种糖醒酸和6种葡萄糖胺），从而使 得肝素的整个结构变得异常复杂（高宁国，.肝素结构与功能的研究进展，生物工程进 展，1999, 19,（5) ;4-13)。肝素常与其他粘多糖一起被提取出来，可由己糖醒酸a-艾杜糖 醒酸、葡萄糖醒酸）与硫酸氨基葡萄糖分子W-定的比例交替联结形成具有六糖或八糖单 位的线型链状大分子，其结构单元如下所示（A化ertini R, et al.Qion化oitin-4-Sulfate Protects High Density Lipoprotein against Copper Dependent Oxidation. Archives of Biochemistry and BiopHysis, 1999. 365(1):143-149)；【主权项】1. 一种定量控制类肝素或肝素样品中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法，分为下述 A和B两种方法： 方法A包括下述步骤： 1) 向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨 素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，使其与类肝 素或肝素样品中的硫酸皮肤素进行酶解反应，监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变 化，待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时，终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应； 2) 向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的 蛋白质，使其与溶液中的硫酸软骨素进行酶解反应；监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含 量变化，待硫酸软本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量控制类肝素或肝素样品中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法，分为下述A和B两种方法：方法A包括下述步骤：1)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，使其与类肝素或肝素样品中的硫酸皮肤素进行酶解反应，监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化，待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时，终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应；2)向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，使其与溶液中的硫酸软骨素进行酶解反应；监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化，待硫酸软骨素的含量达到预期含量时，终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应，得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液；方法B包括下述步骤：a)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，使其与类肝素或肝素样品中的硫酸软骨素进行酶解反应；监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化，待硫酸软骨素的含量达到预期含量时，终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应；b)向终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，使其与溶液中的硫酸皮肤素进行酶解反应；监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化，待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时，终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应，得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，苏楠，张翀，梅祥，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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