一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法。具体涉及一组用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，及含有这些引物和探针的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术还提供一种利用微滴式数字PCR技术精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的检测方法，该方法无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏度和重复性，易于标准化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒和寡核苷酸，更确切的说，是一种检测诺如病毒Ⅰ型的反转录—微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-ddPCR))快速定量检测试剂盒。
技术介绍
诺如病毒(Norovirus)属于杯状病毒科，为无包膜单股正链RNA病毒，基因组全长为7.5-7.7kp，包括3个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，其中ORF1编码核苷酸三磷酸酶、蛋白酶和RNA依赖的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)等非结构蛋白，ORF2编码主要结构蛋白VP1，ORF3编码次要结构蛋白。基于RdRP和VP1基因序列信息的不同，诺如病毒可被分为5种基因型GⅠ-GⅤ。其中GⅠ和GⅡ最为常见，为感染人的主要病毒基因型。诺如病毒是全世界范围内引起非细菌性胃肠炎暴发的主要食源性病毒，可感染各年龄组人群，尤其是儿童，引起患者恶心、呕吐、腹痛，甚至低热、头痛、肌痛、乏力及食欲减退等症状。其传播途径为：传染源→粪便→水体(食品)→人体传播，污染的水和食物尤其贝类是传播的主要载体。诺如病毒对环境具有较强的耐受性，在酸性(pH 2.7)条件下、加热(60℃)条件及自来水中游离氯(3.75～6.25mg/L)浓度条件下，仍具感染性，预防手段十分有限。因此，对环境和食品中诺如病毒进行检测和分析，有利于水体环境及贝类海产品诺如病毒污染风险评估的开展，进而对食源性病毒病的暴发进行有效的预警，保护人类健康，保障食品贸易正常进行。虽然诺如病毒Ⅰ型是严格的细胞内寄生物，在食品中不能繁殖，但是其感染性强，甚至少于102拷贝数/mL的病毒颗粒都能导致感染。而可能存在诺如病毒Ⅰ型污染的食品样品中，其病毒滴度通常处于比较低的水平。因此需要一种针对诺如病毒Ⅰ型的精确定量检测方法，实现对诺如病毒Ⅰ型的有效监控。目前，诺如病毒Ⅰ型的定量检测方法主要包括以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)基础的实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,RT-qPCR)和反转录－环介导恒温核酸扩增(Realtime reverse transcription lood-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)法。这两种方法需要经过仔细校准的标准曲线和稳定的诺如病毒Ⅰ型标准物质，而且每次检测都需建立标准曲线，因此，结果分析中潜在主观因素的存在，造成了多次检测间结果的差异和不同实验室间结果的多样性，影响诺如病毒Ⅰ型定量检测的标准化和规范化。近年来发展起来的数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术是一种全新的核酸定量检测方法。目前，数字PCR包括：微反应室/孔板数字PCR(Chamber Digital PCR,cdPCR)、微流体数字PCR(Microfluidic Digital PCR，mdPCR)(大规模集成微流控芯片)和微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)三种dPCR系统。目前，国内外均未见利用RT-ddPCR进行诺如病毒Ⅰ型定量检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测诺如病毒Ⅰ型的RT-ddPCR引物和探针。本专利技术的另一个目的是提供一种操作简单、结果准确的诺如病毒Ⅰ型RT-ddPCR快速定量检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术通过分析诺如病毒Ⅰ型的基因组构成，选取其分型基因片段RdRp-VP1，设计出特异性引物和探针，所述用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针的序列见表1，其中，探针5’标记FAM，3’标记BHQ。表1 RT-ddPCR引物和探针序列本专利技术还提供一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针。进一步地，该试剂盒还包括完成RT-ddPCR反应所需材料和试剂，例如诺如病毒Ⅰ型阳性对照RNA、one-step RT-ddPCR supermix、醋酸镁、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜等，上述材料和试剂优选为单独包装。本专利技术还提供了一种诺如病毒Ⅰ型精准定量的检测方法，即RT-ddPCR方法，其包括以下内容：1.提取待测样品RNA，可以使用传统Trizol法提取方法或商业化试剂盒进行提取；2.配制RT-ddPCR反应体系，其中，所述反应体系包括序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示的引物和探针。在本专利技术的一个具体实施方案中，RT-ddPCR反应体系如表2所示；表2诺如病毒Ⅰ型ddPCR反应体系3.将步骤2.配制的RT-ddPCR反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴；4.进行扩增反应，反应条件见表3；表3诺如病毒Ⅰ型RT-ddPCR反应条件注：升降温速度应≤2.5℃/s5.结果判定。将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得RT-ddPCR反应体系内诺如病毒Ⅰ型目的片段含量，进而通过RNA模板加样量(2μL)和提取的RNA模板体积数，按以下公式计算获得样品中诺如病毒Ⅰ型的精准定量。本专利技术的优点是：1)对核酸分子的绝对定量避免了由PCR扩增效率差异所导致的偏差；2)无需依赖有证标准物质或其他标准品；3)具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易于标准化；4)更适合低拷贝数的核酸检测；5)由于RT-ddPCR是终点检测，对抑制剂的耐受度更高，因此可降低由基质类型所导致的检测偏差。下面结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明，凡依照本专利技术公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本专利技术的保护范围。附图说明图1不同退火温度条件下诺如病毒Ⅰ型目的片段RT-ddPCR检测结果。图2 RT-ddPCR试剂盒检测诺如病毒Ⅰ型特异性分析结果。图3 RT-ddPCR试剂盒检测诺如病毒Ⅰ型灵敏度分析结果。图4 RT-ddPCR试剂盒检测诺如病毒Ⅰ型重复性分析结果。具体实施方式实施例1 RT-ddPCR引物、探针设计为实现对诺如病毒Ⅰ型的特异性检测和绝对定量分析，我们选取诺如病毒分型基因片段RdRp-VP1，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出10余对引物和探针组合，经过筛选最终获得特异性强、适用于RT-ddPCR引物/探针组合各1套，序列见表1。其中探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。引物/探针均由北京六合通经贸有限公司合成。实施例2检测方法的建立(1)RNA提取：利用商业化试剂盒进行提取；或者利用传统Trizol法提取RNA，具体操作如下：①在100μL样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增诺如病毒Ⅰ型RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增诺如病毒Ⅰ型RNA的探针。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增诺如病毒Ⅰ型RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增诺如病毒Ⅰ型RNA的探针。2.根据权利要求1所述的用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针，其特征在于：探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。3.一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的一组用于检测诺如病毒Ⅰ型的引物和探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括诺如病毒Ⅰ型阳性对照RNA、one-ste...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐蕾蕊，曾静，赵晓娟，马丹，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：北京;11