同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了采用荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5和H7四种亚型的试剂盒和方法，试剂盒中包括对应各流感病毒亚型的特异性引物和探针。本发明专利技术提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，检测的特异性强，灵敏度高；检测方法实现了对同一个样本，可进行4种流感病毒分型的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7的试剂盒及方法。
技术介绍
流行性感冒病毒(influenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。流行性感冒简称流感,主要是指人群中，由普通流感病毒引起的一种病毒性急性呼吸道传染病。流感传染性强，传染迅速，会导致每年的流行，并且历史上每隔几十年会造成流感大流行，在短时间内使很多人患病甚至死亡。对流感疫情的防控最根本的途径就是早发现、早诊断、早治疗和切断传染源。由此可见，快速灵敏的流感病毒检测技术成为了保护人民生命健康、防控疫情在国内大范围流行的第一道屏障。现有的快速检测技术主要有两类：第一类为免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法、同位素标记抗体法、乳胶凝集法、免疫传感器法、免疫扩散法及免疫色谱法等；第二类是以核酸为基础的分子生物学方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)。免疫学方法是以抗原抗体结合来用于检测，检测需要制备特异性抗原或抗体，制备过程复杂，且需要保持使用的抗原或抗体具有免疫原性活性，该检测的灵敏度较低，易出现假阴性。PCR方法是核酸扩增技术的典型代表，该技术是由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullin等人于1985年专利技术的，在过去的二十年里，PCR技术作为分子生物学的核心得到了迅猛的发展和应用，特别是在疾病的临床检测病毒中，PCR技术以其快速、灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。多重PCR，是指在同一个PCR反应体系中加入二对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有的优点有高效性、系统性、经济简便性。但因PCR成功的关键在于设计出合理的引物，合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。而多重PCR对引物的要求更加严格，如多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度，使得所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增；而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。现有一般检测2重、3重病原检测较多，如现有专利公开号CN101895531B，名称为检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物，记载了其选取的引物间的序列在理论上可以很好地区分H1，H2，H3，H5，H7和H9(选取的300条序列，全部正确的分到所该分的亚型中)，但实际当中，由于涉及到多重引物设计的条件，易出现引物间交叉反应，易导致假阴性的结果，或无法区分出这几种分型，目前也仅能检测出H1、H3两种分型。目前还没有针对流感病毒H1、H3、H5、H7四种分型进行多重PCR的检测方法。因多重PCR对引物设计的要求苛刻，检测的重数越多，限制的条件越多，要达到高灵敏、特异性强的多重检测也就需要付出越多，不仅需要在前期引物设计或探针设计需要人工分析、经验判断，还需要上千次及上万次的实验筛选、验证检测结果。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一组用于同时检测流感病毒流感H1、H3、H5、H7四种亚型的核酸。本专利技术还提供一组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒流感H1、H3、H5、H7四种亚型的试剂盒及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组用于多重PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的核酸，包括流感病毒H1的上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病毒H7的上、下游引物；其中，所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示。一组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的核酸，包括流感病毒H1的上、下游引物和探针、流感病毒H3的上、下游引物和探针、流感病毒H5的上、下游引物和探针、及流感病毒H7的上、下游引物和探针；所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序 列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。一种用于同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的试剂盒，该试剂盒包括：上述流感病毒H1、H3、H5、H7的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。如上所述的试剂盒，优选地，还包括2×RT-PCR缓冲液(Buffer)、25×反转录酶和Taq聚合酶混合酶(25×RT/Taq mix)。一种用于荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的方法，该方法是非诊断目的的检测方法，包括以下步骤：(1)从样品中提取病毒RNA；(2)对所述步骤(1)提取的病毒RNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用流感病毒H1的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其5′端和3′端分别对应标记FAM和BHQ1；流感病毒H3的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其5′端和3′端分别对应标记Texred和BHQ2；流感病毒H5上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其5′端和3′端分别对应标记JOE和TAMRA；流感病毒H7上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其5′端和3′端分别对应标记CY5和BHQ3；(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整 取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：1×R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于多重PCR同时检测流感病毒H1，H3，H5，H7亚型的核酸，其特征在于，包括流感病毒H1的上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病毒H7的上、下游引物；其中，所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于多重PCR同时检测流感病毒H1，H3，H5，H7亚型的核酸，其特征在于，包括流感病毒H1的上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病毒H7的上、下游引物；其中，所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示。2.一组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的核酸，其特征在于，包括流感病毒H1的上、下游引物和探针、流感病毒H3的上、下游引物和探针、流感病毒H5的上、下游引物和探针、及流感病毒H7的上、下游引物和探针；所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。3.一种用于同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2所述的流感病毒H1、H3、H5、H7的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×RT-PCR缓冲液及25×反转录酶和Taq聚合酶混合酶。5.一种用于荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5、H7亚型的方法，其特征在于，该方法是非诊断目的的检测方法，其包括以下步骤：(1)从样品中提取病毒RNA；(2)对所述步骤(1)提取的病毒RNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用流感...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇，王静，王建成，赵婷婷，李辉，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11