土曲霉CCF 3059 α‑L‑鼠李糖苷酶突变体及其应用，包括如SEQ ID NO:2所示的D594Q基因、SEQ ID NO:3所示的D594R基因、SEQ ID NO:4所示的D594C基因、SEQ ID NO:5所示的G827K基因、SEQ ID NO:6所示的G827M基因和SEQ ID NO:7所示的G828A基因。突变酶MRha‑D594Q最适温度和原酶MRha均为65℃；但与原酶MRha相比，突变酶MRha‑D594Q在70℃和75℃时仍保持较高的酶活性；添加山梨醇能够进一步提高突变酶MRha‑D594Q的热稳定性，在70℃的半衰期提高了7.8倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及酶工程领域，具体涉及土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶突变体及其应用。
技术介绍
α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是一种重要的糖苷水解酶，它能够特异性水解许多末端含有非还原性α-L-鼠李糖的天然的糖苷类化合物，如芦丁，柚皮苷，橘皮苷，甜菊苷，杨梅苷等。α-L-鼠李糖苷酶的来源比较广，广泛分布在自然界的植物、细菌、真菌、动物肝脏中。CAZy(http://www.cazy.org/)数据库中糖苷水解酶的分类依据是氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在三个糖苷水解酶家族(glycosidehydrolasefamily，GH)，分别是GH13、GH78和GH106。α-L-鼠李糖苷酶在食品工业中具有广泛的应用价值。众所周知，很多水果都含有柚皮苷、橘皮苷等苦味物质。α-L-鼠李糖苷酶能够水解芸香科水果中的柚皮苷和柠檬苦素等苦味物质，从而很大程度上降低苦味，改善果汁的口感；α-L-鼠李糖苷酶还能够水解葡萄酒中大量的键合态芳香物质，释放出糖苷配基，产生游离的芳香物质，使葡萄酒增香并提高风味。同时，α-L-鼠李糖苷酶能定向水解含有鼠李糖苷的天然活性物质或天然药物，提高原有物质的生物活性和生物利用度。此外，α-L-鼠李糖苷酶在化合物的结构鉴定、改进抗癌药物的靶向性方面也有广泛的应用。然而，α-L-鼠李糖苷酶在工业中进行规模化推广应用还存在障碍和技术瓶颈：(1)现有菌株产α-L-鼠李糖苷酶的活力不够高，直接导致了使用成本较高。(2)大多数报道的α-L-鼠李糖苷酶最适反应温度在40～60℃之间，在高温条件下热稳定性较差，这不利于底物的溶解及产物的纯化。本专利技术申请人在研究中克隆表达了土曲霉CCF3059来源的α-L-鼠李糖苷酶基因Rha，通过优化密码子的偏好性，得到了优化后的α-L-鼠李糖苷酶基因MRha，并构建重组质粒pPICZαA-MRha，使其表达水平大幅提高，摇瓶最高酶活力达到1000U/mL，远远高于到目前为止国内外报导的最好水平。该酶具有优良的最适作用温度、最适作用pH及较好的pH稳定性，但在温度高于70℃条件下该酶不稳定。提高该酶的热稳定性将有望大幅提高该酶实际使用效果。目前，提高酶的热稳定性的方法主要包括：(1)定向进化：通过随机突变，定点突变，饱和突变等技术，筛选得到热稳定性较好的突变株；(2)从嗜热微生物中筛选热稳定性较好的酶；(3)酶的固定化；(4)酶的化学修饰；(5)添加稳定剂，如多羟基化合物，金属离子等。虽然通过以上技术可以提高酶的热稳定性，但还未见利用这些技术手段，特别是利用两种或两种以上手段提高α-L-鼠李糖苷酶稳定性的报道。本研究将对已经实现超量表达的土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶基因MRha为研究对象，从定点突变和添加稳定剂这两个方面着手来提高其耐热性能。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供了一种土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶突变体及其应用。本专利技术分为两步：(1)获得土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶的突变基因，其编码对应的突变酶在70℃下的热稳定性有明显提高；(2)通过大量筛选，获得一类多羟基化合物，能进一步提高突变酶在70℃下的热稳定性。从而在工业生产过程中可以采用较高的操作温度，以提高反应速率，增加底物溶解度，降低酶的失活率，从而有利于该酶的生物催化转化。技术方案：土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶突变体基因，包括如SEQIDNO:2所示的D594Q基因、SEQIDNO:3所示的D594R基因、SEQIDNO:4所示的D594C基因、SEQIDNO:5所示的G827K基因、SEQIDNO:6所示的G827M基因和SEQIDNO:7所示的G828A基因。上述突变体基因翻译对应的土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶。土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。一种催化转化天然活性物质或天然药物中鼠李糖苷的组合物，包括酶稳定剂和上述土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶。上述酶稳定剂为山梨醇、Ca2+、甘氨酸、甘油或PEG1000，浓度为0.2-2mol/L。上述组合物在催化转化芦丁制备异槲皮素中的应用。有益效果：1.突变酶MRha-D594Q最适温度和原酶MRha均为65℃；但与原酶MRha相比，突变酶MRha-D594Q在70℃和75℃时仍保持较高的酶活性；2.突变酶MRha-D594Q的温度稳定性相对于原酶MRha有大幅提高，在70℃的半衰期提高了190％。3.添加山梨醇能够进一步提高突变酶MRha-D594Q的热稳定性，在70℃的半衰期提高了7.8倍。4.相比较于原酶，重组酶MRha-D594Q能够显著提高在70℃下芦丁的转化效率，在重组酶MRha-D594Q中添加一定浓度的山梨醇能够进一步提高在70℃下芦丁的转化效率，摩尔转化率达到98％。附图说明图1为原酶及突变α-L-鼠李糖苷酶热稳定性比较示意图；图2为稳定剂对突变酶D594Q热稳定性的影响示意图；图3为原酶，突变酶D594Q的最适温度示意图；图4为原酶，突变酶D594Q及突变酶D594Q添加山梨醇的热稳定性比较示意图；图5为原酶，突变酶D594Q及突变酶D594Q添加山梨醇对芦丁的转化效率比较示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。实施例11.重组质粒pPICZαA-MRha的获得及突变位点的确定全基因合成并通过酵母密码子偏好性优化土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:8，将其连接到pPICZαA质粒上，获得的重组质粒命名为pPICZαA-MRha，转化PichiapastorisKM71H。研究表明酶蛋白Loop区对酶的热稳定性密切相关，此外氨基酸B-Factor值越大越不稳定。通过同源建模，获得土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶的三维结构，基于上述理论寻找突变位点，利用生物信息学软件DiscoveryStudio对该突变点的突变能进行分析，筛选突变势能较低的突变体作为研究对象，最终确定的突变体为D594Q，D594R，D594C，G827K，G827M，G828A。突变引物设计：利用生物信息学分析及同源建模比对，改变α-L-鼠李糖苷酶MRha分子部分氨基酸，设计突变点。利用反向PCR技术获得突变序列，每个突变位点设计正反两条寡核苷酸序列。突变体选用酵母偏爱密码子，突变引物如下表。表1定点突变引物表2.携带突变基因的系列重组质粒的构建2.1重组质粒pPICZαA-MRha-D594Q的构建以重组质粒pPICZαA-MRha为模板，利用反向PCR技术将594位的天冬氨酸突变成谷氨酰胺，获得携带有突变基因SEQIDNO：2的重组质粒pPICZαA-MRha-D594Q表2反向PCR反应液的配制(共50μL本文档来自技高网...
【技术保护点】
土曲霉CCF 3059 α‑L‑鼠李糖苷酶突变体基因，其特征在于包括如SEQ ID NO:2所示的D594Q基因、SEQ ID NO: 3所示的D594R基因、SEQ ID NO: 4所示的D594C基因、SEQ ID NO: 5所示的G827K基因、SEQ ID NO: 6所示的G827M基因和SEQ ID NO: 7所示的G828A基因。
【技术特征摘要】
1.土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶突变体基因，其特征在于包括如SEQIDNO:2所示的D594Q基因、SEQIDNO:3所示的D594R基因、SEQIDNO:4所示的D594C基因、SEQIDNO:5所示的G827K基因、SEQIDNO:6所示的G827M基因和SEQIDNO:7所示的G828A基因。2.权利要求1所述突变体基因翻译对应的土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶。3.根据权利要求2所述土曲霉CCF3059α-L-鼠李糖苷酶，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，葛林，石学佳，裴建军，吴涛，陈安娜，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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