热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用。本发明专利技术选择野生型酸性普鲁兰酶的6个位点进行定点突变，从中筛选出3个热稳定性提高的单点突变体。本发明专利技术进一步在单点突变的基础上进行组合突变，获得热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶组合突变体，其中组合突变体PulB‑D328H/N387D/A414P的Tm比突变前提高了4.91℃，在65℃下处理10min后，其残余酶活是突变前的12.4倍。本发明专利技术进一步公开了含有所述酸性普鲁兰酶突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明专利技术所述酸性普鲁兰酶突变体的热稳定性和催化效率明显提高，在食品、化工或纺织等领域具有更好的应用前景。

Acid pullulanase mutant and its encoding gene and application to enhance the thermal stability of

The present invention discloses acid pullulanase mutant and its encoding gene and application for improving thermal stability. The invention selects 6 loci of wild type acid pullulanase was mutated and screened 3 single point mutants to improve the thermal stability of the. The present invention further combination of mutations in single point mutation on the basis of the obtained pullulanase combination mutant improved the thermal stability and catalytic efficiency, the combination of D328H/N387D/A414P Tm mutant PulB than mutation increased by 4.91 DEG C, 10min at 65 DEG C, the residual enzyme activity is 12.4 times before suddenly. The present invention further discloses containing the acid pullulanase gene encoding mutant recombinant expression vector and recombinant host cells. The thermal stability and catalytic efficiency of the acid pullulanase mutants significantly improved, better application prospect in the field of food, chemical engineering or textile etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酸性普鲁兰酶突变体，尤其涉及一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，本专利技术还涉及编码所述酸性普鲁兰酶突变体的基因，属于酸性普鲁兰酶突变体的构建及其应用领域。
技术介绍
淀粉作为最常见的碳水化合物之一，一般含75％到80％的支链淀粉。在糖化过程中，糖化酶只能特异性水解α-1,4-糖苷键，对组成淀粉分支结构的α-1,6-糖苷键的作用有限。普鲁兰酶(EC3.2.1.41)作为最广为人知的淀粉脱支酶，能特异性水解支链淀粉的分支α-1,6-糖苷键，属于α-淀粉酶家族。如果在糖化过程中添加脱支酶和糖化酶协同作用，可将淀粉质原料的转化率提高到97％以上，大幅提高生产效率，降低生产成本。此外，普鲁兰酶在燃料乙醇、低热量的啤酒、抗性淀粉、麦芽三糖等产品的生产过程中也起着重要作用。目前为止，多种不同物种来源的普鲁兰酶已经被分离得到，如芽孢杆菌、微小杆菌属、热袍菌属、克雷伯氏菌等；不同来源的普鲁兰酶，酶学性质也各不相同。由于糖化工艺需在60℃以上和pH4.5的条件下进行，所以大多数天然的普鲁兰酶的酶学性质限制了其在工业生产中的应用。来源于Bacillusnaganoensis(AB231790.1)酸性普鲁兰酶PulB，最适温度60℃，最适pH4.5，符合糖化工艺条件，但是此酸性普鲁兰酶PulB的热稳定性较差，不能在工艺条件下始终维持最高的酶活力，因此通过蛋白质工程技术提高Bacillusnaganoensis普鲁兰酶PulB的热稳定性，意义重大。随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，通过理性设计进行定点突变已成为常用的定向改良蛋白质工程技术，是提高工业用酶热稳定性的主要手段，也是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。到目前为止，通过理性设计定点改造基因，已经被成功运用到许多不同普鲁兰酶的稳定性改良研究中。因此，通过对Bacillusnaganoensis(AB231790.1)酸性普鲁兰酶PulB进行定点突变，获得的热稳定性和催化效率提高的酸性普鲁兰酶突变体，将更适合工业应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，通过对来源于Bacillusnaganoensis(GenBankAB231790.1)的酸性普鲁兰酶PulB进行多轮定点突变，获得热稳定性和催化效率提高的酸性普鲁兰酶单点突变体和多点组合突变体；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供编码所述酸性普鲁兰酶突变体的基因；本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供所述酸性普鲁兰酶突变体在食品、化工或纺织工业中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，所述突变体选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：(a)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸获得的突变体，即PulB-D328H；或(b)、将野生型酸性普鲁兰酶的第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体，即PulB-N387D；或(c)、将野生型酸性普鲁兰酶的第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体，即PulB-A414P；或(d)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，且第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体，即PulB-D328H/N387D；或(e)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，且第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体，即PulB-D328H/N387D/A414P。本专利技术突变体的命名方式为，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示突变体，如D328H，表示位置328的氨基酸由亲本普鲁兰酶的Asp(D)替换成His(H)，位置的编号对应于亲本普鲁兰酶的氨基酸序列。本专利技术所述野生型酸性普鲁兰酶(PulB-WT)的氨基酸序列为SEQIDNo.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。本专利技术进一步公开了所述酸性普鲁兰酶突变体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。当所述突变体选自(a)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示；所述突变体选自(b)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.7所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.8所示；所述突变体选自(c)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.9所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.10所示；所述突变体选自(d)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.12所示；所述突变体选自(e)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示。本专利技术采用同源建模、序列比对分析、保守位点分析，选择Bacillusnaganoensis(GenBankAB231790.1)来源的酸性普鲁兰酶PulB-WT的6个位点进行突变，分别获得了A287K、D328H、N387D、A414P、I662V、V687S六个单点突变体。突变前后酶的热稳定性比较结果表明，突变酶PulB-D328H在60℃下的热稳定性最好，其次为PulB-N387D，再次为PulB-A414P，而其余的几个单点突变体稳定性均差于PulB-WT；单点突变体PulB-D328H、PulB-N387D及PulB-A414P的比活力均与PulB-WT相近，没有下降。单点突变体PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P的Tm分别比PulB-WT提高了1.69℃、0.38℃和1.16℃。本专利技术进一步分别选择离328位点距离较近的D321、D331两个位点突变成D321H、D331H，选择离414位点距离较近的A411、A448两个位点突变成A411P、A448P。野生型和单点突变体在60℃处理不同时间剩余酶活的比较结果表明，突变体PulB-D321H、PulB-D331H、PulB-A411P和PulB-A448P的热稳定性均差于PulB-WT；此外，突变体PulB-D321H、PulB-D331H、PulB-A411P和PulB-A448P的比活力均较PulB-WT有不同程度的大幅下降。上述实验结果证明，D328H和A414P是有效提高突变体热稳定性的特定位点。因此，本专利技术筛选出3个热稳定性强于PulB-WT的突变体，即PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P。由于单个突变对蛋白质热稳定性的影响往往是独立存在的，而且存在叠加效应，为了进一步提高PulB的热稳定性，本专利技术在PulB-D328H的基础上，进行了D328H/N387D和D328H/N387D/A414P的组合突变。在65℃处理不同时间剩余酶活的比较结果表明，在65℃保温5min后，PulB-D328H的剩余酶活还有87.9％，PulB-D328H/N387D的剩余酶活还有92.7％，PulB-D328H/N387D/A414P的剩余酶活还有100％，然而PulB-WT只剩24.7％。在65℃保温10min后，PulB-D328H的剩余酶活还有49.6％，PulB-D328H/N387D的剩余酶活还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：(a)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸获得的突变体；或(b)、将野生型酸性普鲁兰酶的第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体；或(c)、将野生型酸性普鲁兰酶的第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体；或(d)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，且第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体；或(e)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，且第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：(a)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸获得的突变体；或(b)、将野生型酸性普鲁兰酶的第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体；或(c)、将野生型酸性普鲁兰酶的第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体；或(d)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，且第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体；或(e)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，且第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体。2.按照权利要求1所述的酸性普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述野生型酸性普鲁兰酶的氨基酸序列为SEQIDNo.3所示。3.按照权利要求1所述的酸性普鲁兰酶突变体，其特征在于：所述突变体选自(a)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.5所示；所述突变体选自(b)时，其氨基酸序列为SEQIDNo.7所示；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：初晓宇，伍宁丰，田健，吕金芝，常美会，刘晓青，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11