本发明专利技术公开一种耐酸性高温α‑淀粉酶的基因、工程菌及其制备方法，该耐酸性高温α‑淀粉酶在pH4.2‑4.6、95℃条件下较文献报道的突变体热稳定性增强，并且表达量是现有耐酸性高温α‑淀粉酶的50倍，将该酶应用于化工、食品、医药等领域，可以在强酸性和高温条件下高效降解淀粉，并能简化工艺、减少环境污染，具有广阔的应用前景。同时本发明专利技术使用的这种结合结构预测的合理设计对于提高工业酶的热稳定性具有重要指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和DNA重组技术，尤其是一种耐酸性高温α-淀粉酶的基因、工程菌及其制备方法。
技术介绍
α-淀粉酶在工业生产尤其是淀粉深加工中具有极其重要的作用。淀粉深加工通常包括液化和糖化两个步骤。液化时，将湿淀粉颗粒与酶混匀后105℃蒸汽加热，然后在90℃水解1-1.5h，液化前将淀粉浆或玉米浆的pH值由自然的pH4.5调到pH5.8-6.2，糖化过程时再将它降为pH4.2-4.5。而α-淀粉酶的使用受最适温度及最适反应pH局限。在工业上使用的主要是来源于芽孢杆菌、耐高温放线菌属和高温单胞菌属的α-淀粉酶。目前工业上应用最广泛的α-淀粉酶为来自地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶(BLA)，其作用条件为95℃，pH6.0，作用过程中需要添加钙离子以保持其活力及热稳定性。由于pH的调节需要添加酸碱，最后还需要除盐，这些都会增加水蒸气和成本以及伴随pH调整不当而产生的副产物，如果使用耐酸耐高温的α-淀粉酶将大大改善这一现状。因此，国内外许多实验室均开展了耐酸性高温α-淀粉酶的研究。早期有1981年摩尔根从嗜中温地衣芽孢杆菌中分离得到的一种极耐高温的α-淀粉酶，其最适pH为6、最适温度为90℃，随后即得到广泛的应用。运用基因工程手段构建耐酸性高温α-淀粉酶生产菌是各国研究者最常用的方法。日本一项专利报道的BLA4480其最适pH为4.0-5.5，最适温度为90-110℃。Mithchinson等人研究发现BLA突变体M15T/H133Y/N188S/A209V(TYSV)在pH5.0，83℃，5mM CaCl2存在的条件下的半衰期是野生型BLA的23倍；DayAG等人在此突变基础上又添加了两个突变位点S148N和A379S，得到的突变体(TYNSVS)被证明在pH4.85，83℃条件下半衰期比TYSV提高了2倍。Mischa Machius等人在2003年发表的文章中介绍，在BLA中引入H133I/N190F/A209V/Q264S/N265Y五个位点突变，使得突变体的失活温度较野生型升高13℃并且在85℃的半失活时间较野生型BLA增加32倍。在2003年，Nathalie Declerck等人在BLA中引入H133I/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y七个位点突变，与野生型相比，其半失活温度升高了23℃、在85℃失活时间增加了100倍以上。Manuel Heriberto Rivera等人发现：引入V286Y单点突变使得突变体水解淀粉的活力较野生型提高5倍。国内也有学者对耐酸性及耐高温α-淀粉酶开展了研究，但是获得的α-淀粉酶仍不能兼具耐热和耐酸的特性，不能满足淀粉深加工工业的要求，因此需要开发一种在低pH和高温条件下具 有高稳定性的耐酸性高温α-淀粉酶以满足淀粉工业条件要求。
技术实现思路
本专利技术提供一种耐酸性高温α-淀粉酶的基因、工程菌，具有良好的热稳定性，在pH4.2-4.6，95℃下保温120min残余活力仍保持在100％；同时该耐酸性高温α-淀粉酶的表达量较已知报道中其他耐酸性高温α-淀粉酶高。本专利技术进一步公开了一种耐酸性高温α-淀粉酶的基因、工程菌的制备方法，满足淀粉深加工工业需求的耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌的制备。本专利技术所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶基因，其基因序列见如SEQ no.1。本专利技术所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶工程菌，含有如权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶基因。而且，所述工程菌的宿主细胞为短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。而且，所述工程菌为胞外蛋白酶缺失的短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis sp3而且，所述工程菌中的表达载体为pNY326。本专利技术所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶，具有权利要求1所述的基因编码的蛋白序列。而且，所述的耐酸性高温α-淀粉酶在pH4.2-4.6，95℃条件下具有高的热稳定性。而且，所述的耐酸性高温α-淀粉酶在工程菌中表达量高。本专利技术所述的一种耐酸性高温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：1)出发序列为耐高温α-淀粉酶(BLA)基因；所述BLA基因序列见如SEQ no.2；2)根据文献报道的BLA突变位点，构建了五个具有耐酸耐高温特性的BLA突变体：BLA-L134R/S320A(简写为BLA-4480)、BLA-M15T/H133Y/L134R/N188S/A209V/S320A(简写为BLA-m6)、BLA-M15T/H133Y/L134R/S148N/N188S/A209V/S320A/A379S(简写为BLA-m8)、BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(简写为BLA-m7)、BLA-H133I/L134R/H156Y/A181T/N190F/A209V/Q264S/N265Y/S320A(简写为BLA-m9)；3)分别对这五个BLA突变体进行表达纯化，测定其在pH4.5条件下的热稳定性；4)利用SWISS-MODEL软件对上述五个BLA突变体及耐高温α-淀粉酶进行结构 模拟，获得其空间结构，对其进行结构分析和动力学模拟分析；5)通过对淀粉酶结构分析、分子动力学模拟分析及热稳定性分析结果，确定构建耐酸性高温α-淀粉酶基因的突变位点；6)设计突变引物，将BLA基因进行定点突变，突变位点为权利要求10(5)所述位点，获得耐酸性高温α-淀粉酶基因；7)将上述耐酸性高温α-淀粉酶基因与表达载体pNY326连接、构建获得带有耐酸性高温α-淀粉酶基因的重组载体；8)将含有耐酸性高温α-淀粉酶基因的重组载体转化入宿主菌株短小芽孢杆菌中，构建获得重组菌株；9)将重组菌株进行分泌表达，获得耐酸性高温α-淀粉酶；10)对耐高温α-淀粉酶及耐酸性高温α-淀粉酶的酶学性质和热稳定性进行分析验证。本专利技术的积极效果如下：提供了一种新的耐酸性高温α-淀粉酶基因、工程菌及耐酸性高温α-淀粉酶，该耐酸性高温α-淀粉酶在pH4.2-4.6、95℃条件下较文献报道的突变体热稳定性增强，并且表达量是现有耐酸性高温α-淀粉酶的50倍，将该酶应用于化工、食品、医药等领域，可以在强酸性和高温条件下高效降解淀粉，并能简化工艺、减少环境污染，具有广阔的应用前景。同时本专利技术使用的这种结合结构预测的合理设计对于提高工业酶的热稳定性具有重要指导意义。附图说明图1：pNY326载体质粒图谱；图2：BLA的3D空间结构及突变位点示意图；图3：突变前后，淀粉酶热稳定性变化趋势。具体实施方式为了便于理解本专利技术，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本专利技术的阐释而非对本专利技术的任何形式的限制。实施例1：耐酸性高温α-淀粉酶基因的构建1、BLA突变体的构建根据文献报道的BLA突变位点，设计相应的定点突变引物(表1)，以BLA为出发序列，采用全质粒PCR的方法构建五个BLA突变体，将这五种突变体在同一表达载体。 同一宿主细胞中进行表达，获得五种突变耐酸性高温α-淀粉酶；2、BLA突变体的酶学性质测定及分析根据酶学性质分析发现，BLA-m9和BLA-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐酸性高温α‑淀粉酶基因，其基因序列如SEQ no.1。
【技术特征摘要】
1.一种耐酸性高温α-淀粉酶基因，其基因序列如SEQ no.1。2.如权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶基因的制备方法，其特征在于：以耐高温α-淀粉酶基因为出发序列，进行如下位点突变：M15T/H133I/L134A/H156Y/A181T/N190F/A209V/ Q264S/N265Y/S320A得到的突变基因。3.一种耐酸性高温α-淀粉酶的工程菌，其特征在于：含有权利要求1所述的耐酸性高温α-淀粉酶基因。4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主细胞为短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。5. 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为胞外蛋白酶缺失的短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis sp3。6.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌中的表达载体为pNY326。7.一种耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于：具有权利要求1所述的基因编码的蛋白序列。8.如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于：所述α-淀粉酶在pH4.2-4.6，95℃条件下具有高的热稳定性。9.如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶，其特征在于：所述α-淀粉酶在权利要求3所述的工程菌中表达量高。10.如权利要求7所述的耐酸性高温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：1）出发序列为耐高温α-淀粉酶基因；其基因序列见如SEQ no.2；2）构建了五个耐酸性耐高温的BL...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢秋宏，师瑞琳，相宏宇，刘玲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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