本发明专利技术公开了一种耐碱性α‑淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用，属于酶工程领域。本发明专利技术采用基因工程技术将来源于碱性芽孢杆菌(Bacillus sp.LS‑04)的耐碱性α‑淀粉酶基因克隆入pPIC9k质粒，以P.pastoris为表达宿主细胞，经甲醇诱导重组耐碱性α‑淀粉酶表达活力达到3120U/mL。本发明专利技术的耐碱性α‑淀粉酶在pH8.0–11.0范围内对淀粉均变现出良好的催化活性，可被应用于纺织退浆或洗涤助剂等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程和基因工程
，具体涉及一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
淀粉酶是一类以淀粉、长链糊精和糖原等葡聚糖为底物的一类酶的总称，按产生底物异构类型的不同可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种；按淀粉水解方式的不同还可以内切型、外切型、脱枝和转移等4个种类。α-淀粉酶即为内切型淀粉酶的一种，其水解产物通常为短链糊精、寡糖和葡萄糖，在食品、制药、酒精、有机酸以及饲料和洗涤行业具有广泛应用。普通α-淀粉酶的作用pH范围较窄，一般在pH5.0–8.0之间，而在该pH范围之外的理化条件下催化活力急剧下降而无法满足工艺使用需求。通常采取的措施是改变加工工艺，分段处理，以满足淀粉酶的使用条件，这样处理的结果是能源消耗大，费时费力且为环保处理带来压力。因此，随着行业发展的细化和不同加工处理领域条件的限制，对淀粉酶催化性质、性能的要求也越来越高，而传统的普通α-淀粉酶更是无法满足各应用领域的需求，从而产生了对特殊淀粉酶如耐酸性淀粉酶、耐碱性淀粉酶或低温淀粉酶的巨大需求。其中，耐碱性α-淀粉酶是指一类可以在碱性环境中(pH9.0–11.0)对淀粉产生水解作用的一类淀粉酶，在洗涤和纺织退浆等特殊的碱性处理工艺环境中对提高洗涤效率、改进退浆工艺等具有重要应用和巨大需求。在2005年和2008年丹麦Novozymes公司前后推出了碱性α-淀粉酶产品并在纺织退浆和洗涤剂中取得了较好应用效果。我国的中国科学院微生物所、武汉大学和江南大学等科研院校亦相继对碱性α-淀粉酶进行了大量研究，但截止目前我国在该酶的生产领域尚属空白，因此碱性α-淀粉酶已成为我国当前酶制剂行业亟待开发的品种之一。自1971年日本研究者Horikoshi首次报道碱性α-淀粉酶以来，关于碱性α-淀粉酶的研究报道陆续增多并主要集中在产生菌种的筛选、培养和酶的分离纯化和性质研究。碱性α-淀粉酶的产生菌株通常是一类嗜碱微生物，该类微生物通常是一类酶表达量极低的原始野生菌株，通过传统诱变选育很难得到满足工业化生产需求的生产菌株。近年来随着基因工程和蛋白质工程技术的发展而逐渐在碱性α-淀粉酶的基因克隆、异源表达和酶分子改造等方面加大了研究力度，同时也是目前快速对碱性α-淀粉酶基因进行克隆、改造和高效表达一条重要途径。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用，目的是使耐碱性α-淀粉酶具有异源高效表达性。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种耐碱性α-淀粉酶，所述耐碱性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码耐碱性α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种含有权利要求1所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌。所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，所述构件方法包括如下步骤：步骤一，克隆耐碱性α-淀粉酶的基因到重组表达质粒载体；步骤二，将重组表达质粒载体转化到宿主细胞中。所述重组表达质粒载体为pPIC9k质粒。所述宿主细胞为P.pastoris GS115。步骤一所述克隆耐碱性α-淀粉酶的基因的制备方法为：以碱性芽孢杆菌染色体DNA为模板，以简并引物AlamyF1和AlamyR1为扩增引物，扩增引物序列分别如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示，通过PCR扩增方法得到耐碱性α-淀粉酶基因，将该基因与克隆载体相连得到重组质粒，并使用氯化钙转化法导入大肠杆菌，之后进行抽提重组质粒。优选的是，以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)基因组DNA为模板并利用简并引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到耐碱性α-淀粉酶全部编码基因，将该基因与克隆载体pMD19-simple相连接获得重组质粒pMD-Alamy04并使用氯化钙转化法导入大肠杆菌(E.coli)JM109，抽提重组质粒并测序获得该基因的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列信息。所述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)为本专利技术人在研究中筛选获得并发现具有耐碱性α-淀粉酶分泌能力的菌株，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11899，保藏日期2015年12月22日，保藏地点：中国科学院微生物研究所。该嗜碱芽孢杆菌的相关保藏证明已于2016年4月6日提交专利申请时提交，其申请的专利号为201610207503.5。所述简并引物是通过对GenBank中公布的部分碱性α-淀粉酶基因序列进行比对和分析而设计得到的。本专利技术中从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐碱性α-淀粉酶基因具有以下特征：(1)核苷酸数目为1545bp；(2)GC(G+C)含量为49.6％；(3)与NCBI中以公布的Exiguobacterium sp.AT1b全基因组序列(GenBank登录号:CP001615.1)中的一段序列(1378199bp–1379741bp)的相似度最高(96％)，但仍有4％的核苷酸序列信息的差异，表明本专利技术中获得的一种耐碱性α-淀粉酶是一条未报道的新基因。本专利技术中从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐碱性α-淀粉酶具有以下特征(1)所含氨基酸数目为514个；(2)蛋白质分子量MW＝57.3KDa；(3)蛋白质氨基端1-28个氨基酸为信号肽序列；(4)蛋白质成熟肽等电点pI＝6.58；(5)酶的反应温度为30–70℃，优选反应温度为40–60℃；(6)酶的反应pH为8.0–11.0，优选反应pH为9.0–10.0；(7)酶在50℃、pH9.0条件下的半衰期为90min；步骤一所述克隆耐碱性α-淀粉酶的基因到重组表达质粒载体的方法为：通过耐碱性α-淀粉酶成熟肽编码基因设计引物对，以所述重组质粒为模板进行PCR扩增，使用限制性核酸内切酶对PCR产物进行双酶切并与同等双酶切的表达质粒连接、转化获得重组表达质粒载体。优选的是，以耐碱性α-淀粉酶成熟肽编码基因为基础设计一对引物，引物对的序列如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6所示，以重组质粒pMD-Alamy04为模板进行PCR扩增，使用限制性核酸内切酶EcoRI和NotI对PCR产物进行双酶切并与同等双酶切的表达型质粒pPIC9k相连接，转化E.coli JM109，获得重组质粒pPIC9k-Alamy04，抽提该重组质粒并使用限制性核酸内切酶SalI进行线性化酶切，胶回收酶切产物并通过电穿孔法导入宿主菌P.pastoris GS115感受态细胞,再利用营养缺陷型平板和淀粉检测平板筛选获得具有耐碱性α-淀粉酶表达能力的基因工程菌，即携带耐碱性α-淀粉酶基因的重组酵母。所述P.pastoris GS115感受态细胞，其制备方法为：接种P.pastoris GS115单菌落于装有15mL YEPD培养基的三角瓶(250mL)中，于30℃、200rpm培养16h后取0.5mL培养基接种至装有50mL新鲜YEPD培养基的三角瓶(250mL)中，继续在相同的条件下培养12h后于4℃下离心收集细胞并用40mL冰水预冷的无菌双蒸水洗涤两次，然后使用20mL冰水预冷的1mol/L山本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐碱性α‑淀粉酶，其特征在于,所述耐碱性α‑淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种耐碱性α-淀粉酶，其特征在于,所述耐碱性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述耐碱性α-淀粉酶，其特征在于，编码耐碱性α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有权利要求1所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌。4.根据权利要求3所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构件方法包括如下步骤：步骤一，克隆耐碱性α-淀粉酶的基因到重组表达质粒载体；步骤二，将重组表达质粒载体转化到宿主细胞中。5.根据权利要求4所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组表达质粒载体为pPIC9k质粒。6.根据权利要求4所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为P.pastoris GS115。7.根据权利要求4所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤一所述克隆耐...
【专利技术属性】
技术研发人员：李松，汤斌，杨倩，魏胜华，陶玉贵，葛飞，朱龙宝，李婉珍，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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