本发明专利技术涉及一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用重组DNA技术定点突变地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因，得到耐高温α-淀粉酶耐酸性突变基因，即耐酸性高温α-淀粉酶基因，并利用枯草芽孢杆菌表达系统，分泌表达耐酸性高温α-淀粉酶的方法。本发明专利技术解决了现有耐高温α-淀粉酶耐酸性较差，耐高温与耐酸性无法同时兼顾，造成应用受限的问题，满足了一些在酸性和高温环境下进行淀粉原料液化工艺的要求，可提高产品收得率及质量，简化工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和重组DNA技术，尤其是一种耐酸性高温a-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法。
技术介绍
a -淀粉酶(a-1，4-glucan-4-glucanohyddrolase EC 3.2.1.1)能够以淀粉为底物，从淀粉内部水解a-1，4葡萄糖苷键，生成麦芽糖、麦芽 三糖、糊精等还原糖。淀粉在a -淀粉酶的作用下，分离迅速降解，粘度下降，即完成液化。a -淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前工业生产上大都以微生物发酵大规模生产a-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是具有使用价值的a-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢杆菌生产的a-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐高温的a-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此自从1973年开始投入生产以来，可被广泛应用于制糖、酿造、有机酸等以淀粉为原料的深加工工业，是目前工业上用途最为广泛的酶种之一。在实际生产中，淀粉经糊化后的自然pH常常在4. 5左右，但一般a -淀粉酶最适pH为6. 5，所以液化前需加要碱提高pH值。目前，国内外使用量最大的来源于黑曲霉的糖化酶最适PH为4. 3-4. 8，这就要求淀粉液化后，在进行糖化酶糖化前，必须再将pH值调回到4.5左右。且液化中低pH条件有利于减少影响糖液质量的糠醛、氨基葡萄糖等色素物质的形成，提高糖液质量。同时，PH的反复调节既增加了操作步骤，也增大了化学试剂的消耗，需要在最后的终产物处理中利用离子交换将多余的盐分除去。为了给淀粉原料深加工提供更好地工艺条件，提高产品质量和收得率、降低消耗、增加效益、特别是节约工业用粮，开发一种耐酸性高温a -淀粉酶，从而满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，就显得势在必行。目前，研究者主要通过菌种选育和基因工程手段，改善耐高温a-淀粉酶。德国Nielsen经定点突变后获得地衣芽孢杆菌耐高温a -淀粉酶突变体Y290E，在酸性条件下活力提高，但耐热性能降低。美国Richardson从各地深海及酸性土壤环境微生物构建的宏基因组文库中筛选得到三个a-淀粉酶突变体，BD5031及BD5064表现出高活性但并不耐酸或者耐高温，BD5063耐酸耐高温但是活性很低。印度Priyadharshini对部分地衣芽孢杆菌耐高温a -淀粉酶氨基酸序列进行随机突变，获得一个PH适用范围变宽的突变体I57S/W193R,但其催化活性及耐热性能均显著降低。在我国，20世纪90年代中科院微生物研究所研究了嗜热真菌ThermomycesIanuginosus所产的a -淀粉酶，该酶的最适温度和pH分别为65°C和5.0,但其耐热性较差。目前商品化应用的真菌Aspergi I Ius oryzae和Aspergillus awamori所产a-淀粉酶pH范围为5. 0-6. 0，但不耐高温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的BacillusstearothermopiIius,能够产生两种酸性a -淀粉酶,最适pH分别为4. 5和5. 0,最适温度为60°C，可以应用于一定条件下酒糟利用和处理。目前a-淀粉酶难以兼顾耐高温、耐酸性及高活力的特性，因此不能适应我国制糖、酿造、有机酸等以淀粉为原料的深加工工业的要求。为了适应整个淀粉加工行业的需要，满足一些在酸性条件下以淀粉为原料液化工艺的要求，应开发一种在高温、低PH值下活力稳定的耐酸性高温a-淀粉酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐酸性高温a -淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法，本专利技术制备获得的该耐酸性高温a -淀粉酶具有良好的酸稳定性，在pH4. 5，90°C下保温60min残余活力仍保持在40%以上。本专利技术实现目的的技术方案如下一种耐酸性高温a -淀粉酶基因，其基因序列为序列8。一种耐酸性高温a-淀粉酶基因的构建方法，方法为将耐高温a-淀粉酶基因·进行定点突变，第1058位碱基C — T，第1199位碱基A — G，得到耐酸性高温a -淀粉酶基因；所述耐高温a -淀粉酶基因见序列7。一种耐酸性高温a -淀粉酶工程菌，含有如权利要求I所述的耐酸性高温a -淀粉酶基因。而且，所述工程菌的宿主细胞为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。而且，所述工程菌为6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600。而且，所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43。一种耐酸性高温a -淀粉酶，具有如权利要求I所述的基因编码的蛋白序列。而且，所述的a -淀粉酶在温度90°C，pH4. 5下活力稳定。一种耐酸性高温a -淀粉酶的制备方法，其特征在于步骤如下⑴将耐高温a -淀粉酶基因进行定点突变，第1058位碱基C — T，第1199位碱基A — G，得到耐酸性高温a -淀粉酶基因；所述耐高温a -淀粉酶基因见序列7 ；⑵将上述耐酸性高温a -淀粉酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐酸性高温a-淀粉酶基因的重组载体；⑶将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；⑷重组菌株分泌表达，发酵制备耐酸性高温a -淀粉酶。而且，所述步骤⑵中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43。本专利技术的优点和积极效果如下I、本专利技术利用重叠PCR技术，对耐高温a -淀粉酶基因进行定点突变，获得耐酸性高温a -淀粉酶基因(T353I/H400R)，并通过分泌型表达载体，转化枯草芽孢杆菌，使耐酸性高温a-淀粉酶得以表达，制备获得的该耐酸性高温a-淀粉酶具有良好的酸稳定性，在pH4. 5，90°C下保温60min残余活力仍保持在40%以上。2、本专利技术制备的酶适用于一些淀粉深加工行业，对提高淀粉加工原料利用率和产品质量、简化工艺、降低消耗、减少环境污染具有显著效果，不仅具有明显的社会效益，也具有重要的经济效益。附图说明图I为本专利技术耐高温a-淀粉酶的PCR扩增电泳图，其中1、DNA分子量标准，2、耐高温a-淀粉酶基因片段；图2为本专利技术重组质粒pUC-amy酶切验证图,其中1、DNA分子量标准,2、pUC_amy经 BamHI 和 HindIII 双酶切，3、pUC-amy 经 BamHI 单酶切；图3为本专利技术耐高温a -淀粉酶的定点突变示意图；图4为本专利技术耐高温a -淀粉酶(amy)与耐酸性高温a -淀粉酶(amyd)基因序列比对突变位点示意·图5为本专利技术重组载体pBSA43_amyd构建示意图；图6为本专利技术重组菌株分泌表达耐酸性高温a -淀粉酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中I、蛋白分子量标准，2、重组菌株WB600/pBSA43-amyd发酵上清液，3、对照菌株WB600/pBSA43发酵上清液；图7为本专利技术重组菌株分泌表达耐酸性高温a -淀粉酶纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中1、蛋白分子量标准，2、耐酸性高温a-淀粉酶，3、耐高温a-淀粉酶。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术利用定点突变技术对地衣芽孢杆菌耐高温a -淀粉酶基因进行定向改造获得耐酸性高温a-淀粉酶基因，具体为利用重叠PCR技术对耐高温a-淀粉酶基因进行定点突变，第105本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐酸性高温α？淀粉酶基因，其特征在于：其基因序列为序列8。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，路福平，樊帅，徐艳静，胡博，王春霞，王建玲，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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