本发明专利技术提供了一种全新α-葡聚糖酶的基因序列以及氨基酸序列，提供了含有其基因序列的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株，提供了从细丽毛壳中分离纯化一种α-葡聚糖酶的方法。本发明专利技术提供的细丽毛壳α-葡聚糖酶基因序列是首次报道，为进一步的研究和开发该酶奠定了基础。本发明专利技术提供的重组菌株产生的α-葡聚糖酶为分泌型的胞外可溶性蛋白，简化了后续的提取和纯化工艺，有利于实现大规模的工业化生产，填补我国在α-葡聚糖酶开发方面的空白。
【技术实现步骤摘要】
本发 明涉及蛋白纯化和基因工程领域，更具体地，涉及一种细丽毛壳a-葡聚糖酶的纯化工艺，一种细丽毛壳a-葡聚糖酶的基因克隆和基因工程菌的构建。
技术介绍
a -葡聚糖是一种由a -D吡喃葡萄糖单体通过(1_6)，(1_3)等糖苷键形式连接而成的多糖，多为右旋糖苷。不同类型糖苷键所占比例随不同的a-葡聚糖而变化。在医药工业中，分子量20KD，40KD，70KD的低聚a -葡聚糖是优良的血浆代用品，在临床上用于治疗失血性休克等，具有增加血容量，改善微循环等作用。a -葡聚糖是许多致病链球菌胞外多糖的重要成分，与龋齿的发生，致病菌的粘附，能量代谢，抵抗抗菌类药物渗透等过程息息相关。在制糖工业中，a -葡聚糖是微生物(如肠膜明串珠菌，链球菌属等)在感染甘蔗的过程中形成的。这些微生物能够分泌葡聚糖蔗糖酶，催化蔗糖生成葡萄糖并聚合而成a-葡聚糖。在蔗汁中葡聚糖浓度可高达1%，严重的会生成白色的固体状物质(俗称“蔗饭”)。a-葡聚糖的存在严重影响从糖汁澄清到糖的精炼等一系列工艺流程。例如糖分的直接损失；虚高糖分旋光度造成物料衡算的困难，进而影响生产；严重增加糖液的粘度致使澄清，过滤和输送等过程困难；与蔗糖共结晶致使产品纯度不高；糖晶异常，适用性差，无法在饮料等高端领域中使用等。a-葡聚糖酶是可降解a-葡聚糖成低聚葡聚糖或葡萄糖的一类酶的总称。a-葡聚糖酶的应用主要集中在生产药用低聚右旋糖酐，增强抗菌类药物的疗效，预防牙菌斑的形成，防止蔗糖转化为a-葡聚糖，从而缓解a-葡聚糖在制糖过程中的负面影响等方面。a -葡聚糖酶普遍存在于微生物中，具有多种类型和功能，部分品种已实现了工业化生产。其中青霉，毛壳菌等真菌来源的a-葡聚糖酶被认为是工业适用性状最好最高效的。诺维信，杰能科和Sankyo等公司已经开发了 a -葡聚糖酶酶制剂产品并且进行了大量的应用研究。为了满足我国制糖行业可持续发展的要求，实现制糖工艺的清洁，节能和环保，a -葡聚糖酶的研究开发亟待进行。基于现有的a -葡聚糖酶研究，毛壳菌来源的a -葡聚糖酶的应用效果最为理想，但是在蛋白数据库中一直没有相关的序列报道。因此，获取毛壳菌来源a-葡聚糖酶的基因或是蛋白序列，才有可能构建基因工程菌，为该酶的开发利用奠定基础。
技术实现思路
在对a -葡聚糖酶的研究过程中，本申请的专利技术人发现细丽毛壳(chaetomiumgracile)具有很好的葡聚糖酶活性。通过蛋白纯化技术，成功分离得到一种电泳纯的a-葡聚糖酶。通过基因克隆技术，成功克隆到一种a-葡聚糖酶基因。测序比对发现该a-葡聚糖酶基因尚未被NCBI等数据库收录，为一新发现的基因。因此，本专利技术的目的之一在于提供细丽毛壳来源的一种a -葡聚糖酶的分离纯化方法；目的之二是提供细丽毛壳来源的一种a-葡聚糖酶的基因；目的之三是提供包括该a -葡聚糖酶的表达载体和利用该载体构建的重组基因工程菌株。本专利技术蛋白纯化采用的技术方案是采用Potato dextran培养基进行细丽毛壳的产酶发酵。发酵结束后，收集发酵液上清，硫酸铵沉淀，透析，DEAE-sepharose fast flow阴离子交换柱层析，SDS-PAGE检测。本专利技术基因克隆采用的技术方案是提取细丽毛壳的基因组，根据a-葡聚糖酶的保守序列设计引物，通过PCR扩增得到细丽毛壳葡聚糖酶的部分序列，再根据该序列设计数对特异性引物，应用基因走读技术，扩增得到两侧序列。分析两侧序列，再设计引物扩增得到a-葡聚糖酶的完整基因序列(如SEQ ID NO: I所示，对应的氨基酸序列如SEQ IDNI:2所示)。当然，如本领域的技术人员所知，本专利技术的a-葡聚糖酶基因还可以是编码由序列表中SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本专利技术的a -葡聚糖酶不仅仅是具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。本专利技术提供的包括a -葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表达载体是用常规方法将本专利技术的a-葡聚糖酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市 售的质粒、粘粒、卩遼菌体或病毒载体等，如pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen,Inc.，Madison, ffis)，PQE (Qiagen)，pREP, pSE420 和 pLEX(Invitrogen)，但不限于这些载体。较佳的是将PCR扩增到的a -葡聚糖酶基因产物和表达载体pPIC9K连接得到重组质粒。本专利技术提供的转化体，是将包含本专利技术的a-葡聚糖酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，如感受态毕赤酵母KM71或GS115中得到基因工程菌。其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是毕赤酵母，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株。本专利技术提供的a-葡聚糖酶重组菌株可用于a-葡聚糖的水解。在医药领域，a-葡聚糖酶可用于药用低聚葡聚糖的生产；或者用来增强抗生素类药物的疗效；此外，a -葡聚糖酶与肿瘤专一性抗体结合后还可作为与葡聚糖耦合药物的靶标，定向治疗癌症。在口腔疾病防治中，a-葡聚糖酶可以与氟化钠等药物配合使用，既减少了氟化物的毒性，又可以起到良好的抑制牙菌斑发生，预防龋齿的作用。在制糖工业中，a-葡聚糖酶可以将a -葡聚糖转化为小分子的寡糖或是单糖，减少糖液粘度，加速沉降，缩短蒸煮时间，提高糖产量和质量。这种酶法处理工艺对于实现制糖工业的清洁，低碳，环保具有重要意义。具体实施例方式为更好的理解本专利技术的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。本申请所采用的蛋白质纯化技术主要有蛋白质的柱层析分离技术等。本申请所采用的基因操作技术主要有基因克隆和基因的真核表达技术等。在本专利技术的实施例中使用的毕赤酵母Pichia patoris KM71、Pichia patorisGS115及pPIC9K载体均购自Novagen公司，引物均由英俊(invitrogen)公司合成。本专利技术所指a -葡聚糖酶活测定方法以a -葡聚糖dextran 2000为底物。本专利技术所指a-葡聚糖酶活测定方法的国际酶活单位的定义为在本测定条件下，每分钟水解a -葡聚糖产生I U mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位(IU)。在本专利技术的下述实施例中，Potato dextran 培养基的配方如下10% potato, I % peptone, 0. I % KH2P04,0.05% MgS04 7H20,1 % Dextran T2000, pH natural。Luria Bertani 培养基的配方如下I trptone,0. 5 % yeast extract本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种a-葡聚糖酶的基因，是下列核苷酸序列之一 .1)其为序列表中SEQID NO 1所不的喊基序列； .2)编码由序列表中SEQID NO :2所不的氣基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。2.一种a-葡聚糖酶，其是序列表中SEQ ID NO :2所示氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。3.包括权利要求I所述的a-葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表达载体。4.一种高效表达a-葡聚糖酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株表达a -葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示或为其无义突变序列。5.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述a-葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓庆，赵迎春，王风清，王赟，
申请(专利权)人：宁夏夏盛实业集团有限公司，华东理工大学鲁花生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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