一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种糖苷水解酶第18家属(GH18家属)——几丁质酶基因克隆的方法。发明专利技术利用单一碳源的特殊培养基筛选得到产几丁质酶的细菌，采用独特有效的半嵌套简并引物进行细菌GH18家属几丁质酶基因片段的扩增，然后利用sitefinding?PCR方法或反向PCR方法获得全长的几丁质酶基因。然后构建几丁质酶基因的表达质粒，在大肠杆菌中进行基因的诱导表达。本发明专利技术的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型GH18家属几丁质基因克隆方法，为最终构建几丁质酶工程菌株，实现工业化生产几丁质酶奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法。
技术介绍
纤维素、几丁质是自然界含量最为丰富的多糖，蕴含着巨大的生物可利用资源，它们均由吡喃葡萄糖经￠-1,4糖苷键连接而成，不同点在于2号碳上所连接的基团。其中几丁质是由D-乙酰氨基葡萄糖残基构成，在自然界中，真菌、昆虫等体内含量极为丰富。科学界十分关注几丁质、壳聚糖及其水解物，因为它们具有许多重要和有开发潜力的生物学功能，比如杀菌、抗癌等，有些功能已经被实际应用于农业、食品和医药产业。 几丁质酶(EC 3. 2. I. 14)是自然界存在的一类能够催化水解几丁质P _1，4糖苷键的酶类，其存在细菌到真菌，甚至病毒乃至植物中。根据其氨基酸序列分析，几丁质酶可分为18号和19号二个家属，不同家属的酶对底物的特异性、作用方式是不同的。相对于物化方法水解几丁质，酶法水解具有节能、环保、高效、安全、低成本等无可比拟的优势，能够为几丁质原料的食品、制药等行业提供优质产品。该课题的关键在于几丁质酶基因的克隆方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种从产几丁质酶的菌株中快捷克隆几丁质酶基因的方法。本专利技术所述的方法包括如下步骤(I)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列；(2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物；(3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段；(4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物,通过sitefinding PCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。几丁质酶可分为18号和19号两个家属，通过氨基酸序列分析可找出GH18家属的核心保守序列。比对已知的GH18家属的几丁质酶基因，找出其保守序列SIGGWT，FDGIDID和NIMTYD,设计半嵌套简并引物。也可利用软件Block Maker (http://bioinformatics,weizmann. ac. il/blocks/blockmkr/www/make_blocks. html)进行比对和寻找保守区域，然后利用软件 C0DEH0P(http://bioinformatics, weizmann. ac. il/blocks/codehop. html)寻找可能的简并引物。依据引物的基本原则和要求简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的Tm值尽可能相近等，选择适宜的简并引物。根据上述原则，专利技术人设计了三条简并引物GH18FP I :5，-AGYATHGGNGGNTGGCA-3，；GH18FP2 :5， -TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’ ；GH18RP :5’ -TCRTANGTCATDATRTT-3’ ；利用只含几丁质作为唯一碳源的特殊选择性培养基可获取产生几丁质酶的菌株，并抽提其基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板进行PCR。对扩增得到的部分基因片段(250-280bp)进行测序，然后根据获得的各种几丁质酶基因片段的序列设计各自特定的嵌套引物FP1、FP2和RPU RP2。其中，FP1、FP2和RP1、RP2是根据所述步骤(3)扩增得到的特异几丁质酶基因片段(250-280bp)序列设计的，每种几丁质酶基因其引物FP1、FP2、RPl和RP2可根据特异几丁质酶基因片段序列做相应调整。以各细菌的基因组DNA为模板，进行单一酶切与自身环化，然后利用FPl与RPl弓I 物进行反向PCR，再以所得扩增获得的产物作为模板，利用弓I物FP2和RP2进行嵌套PCR。或者利用 SFPl(5’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’)与 FPl (或 RPl)引物进行 Sitefinding PCR,再以所得扩增获得的PCR产物作为模板，利用引物SFP2 (5’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’)与FP2(或RP2)进行嵌套PCR。对获得的几丁质酶基因片段上下游序列进行移步扩增，并对所获得的基因片段进行测序、基因拼接。根据测序、拼接的结果，和现有几丁质酶基因进行比对，根据同源性等的分析，可以获得新型的GH18家属几丁质酶基因。根据测序结果并和现有几丁质酶基因进行比对，发现本专利技术获得了一种新型的几丁质酶基因chi9，其DNA序列和氨基酸分别如Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示，与已公布几丁质酶序列(BAK53879)同源性为60.5%。在不影响几丁质酶蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有几丁质酶活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。因而，优选的，可根据公知常识和逻辑推理，通过对几丁质酶蛋白生物学活性结构域外的氨基酸位点进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸从而获得基本保留几丁质酶生物学活性的蛋白突变体，优选的为对几丁质酶氨基酸位点进行点突变从而获得基本保留几丁质酶生物学活性的蛋白突变体。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响几丁质酶基因表达的条件下，可对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本专利技术还保护对SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留几丁质酶蛋白生物学活性的DNA分子。利用基因克隆技术，可将克隆到的几丁质酶基因接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组几丁质酶。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E. coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)和哺乳动物细胞等，优选采用原核表达系统E. coli。一个优选的例子是将本专利技术克隆到的几丁质酶基因采用设计插入的NdeI和XhoI重组位点连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用0.lmmol/L IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析获得几丁质酶，经分析具有较高的酶活性。本专利技术提供了一种从细菌等生物中克隆GH18家属几丁质酶基因，并进行了表达的方法。本专利技术的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型几丁质基因克隆方法，为最终实现工业化生产几丁质酶打下基础。附图说明图I为克隆、表达几丁质酶基因的流程图。图2为工程菌pET28a_chi9/BL21诱导表达后，含Chi9目的蛋白样品的SDS-PAGE分析 具体实施例方式实施例I产几丁质酶细菌的获得利用以几丁质为唯一碳源的培养基(0.5% colloidal chitin,0. 07 % K2HPO4,0. 03% KH2PO4,0. 05% MgSO4,0. 03% peptone, 0. 03% yeast extract和 1.5% agar,pH 7. 2)培养筛选得到能表达产生几丁质酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从产几丁质酶的菌株中克隆几丁质酶基因的方法，包括如下步骤 (1)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列； (2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物； (3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段； (4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物，通过sitefindingPCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中核心保守序列为SIGGWT, FDGIDID 和 NMTYD。3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中简并引物为 GH18FP I :5’ -AGYATHGGNGGNTGGCA-3’ ；GH18FP2 :5’ -TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’ ；GH18RP :5’ -TCRTANGTCATDATRTT-3’。4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(4)中的嵌套引物FP1、FP2和RP1、RP2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱旭芬，张文武，吴敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：