一种生物工程技术领域的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。该荧光细胞模型是含荧光物质的细胞模型，所述的荧光物质为绿色荧光蛋白，所述的细胞为U2OS人骨肉瘤细胞。其标记方法：利用增强型绿色荧光蛋白转染细胞，建立表达增强型绿色荧光蛋白的稳定细胞。其应用：所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型在测定细胞裂解液中荧光值的变化。本发明专利技术通过测定荧光值直接反映细胞存活和生长的变化，所建立的抗肿瘤药物筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，而且误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物工程
的细胞模型及其标记方法，具体涉及的是一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。
技术介绍
癌症，各种恶性肿瘤的统称，其细胞的生长和分裂速度高于正常细胞，且往往可转移到其他组织。肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，但用于临床的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，因此继续寻找选择性高、毒副作用小的抗癌药是抗肿瘤新药研究的重点。目前筛选抗肿瘤药物的方法包括体外和体内筛选方法。体内筛选方法，即动物实验，是药物应用于有移植性肿瘤的动物进行实验的方法，但因体内筛选需要的技术条件高，难以进行高通量筛选，且靶标不明，动物实验的成本又高，影响因素多，故大批筛选或粗筛时多采用体外筛选。体外筛选方法中最常见的是四氮唑盐酶还原法(Microculture Tetrozolium, MTT)，又称MTT比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的璁珀酸脱氢酶能使外源件MTT还原为水不溶件的蓝紫饩结晶甲谱(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量；在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的优点是灵敏度高、经济。但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。而且MTT有致癌性，溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。最重要的是，MTT 只能用来检测细胞的相对数和相对活力，但不能检测细胞的绝对数。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。本专利技术方法简便、误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞，为U20S-EGFP细胞(4F12G)，已于 2011年4月20日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC NO :4787ο本专利技术涉及的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型是含荧光物质的细胞模型，所述的荧光物质为绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。优选的，所述的绿色荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)。本专利技术涉及上述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的标记方法，利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染U20S人骨肉瘤细胞，建立表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的稳定细胞株。所述的增强型绿色荧光蛋白的表达情况可在荧光显微镜下被监视，表达时不需要加入抗体、辅因子、酶底物等其他成分，不影响宿主细胞。本专利技术涉及上述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的应用，所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型可测定细胞裂解液中荧光值的变化。本专利技术的优点在于，通过测定荧光值直接反映细胞存活和生长的变化，利用该专利技术的细胞模型建立的抗肿瘤药物筛选方法药物作用机制明确，较MTT比色法操作简便、快速、直接，而且误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。附图说明图1为本专利技术的细胞模型建立的抗肿瘤药物选新方法基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与以往最常用体外筛选方法MTT比色法之间的比较的一个优选实施例的结果图；图2为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测细胞生长曲线之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中细胞生长曲线之间的比较:A、C.荧光分析法；B、D. MTT比色法(η = 5)。图3为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中:Α.荧光分析法；B.MTT 比色法。1 μ g/ml ()，0· 2 μ g/ml ( ■ ) (η = 5)。图4为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测不同浓度的同种药物对细胞生长的抑制趋势之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中A荧光分析法；B MTT比色法。阿霉素1 μ g/ml (),0.2μ g/ml ( ■)， 0. 02 μ g/ml ( ▲ )，0· 01 μ g/ml (▼)，0. 002 μ g/ml ()，and 载体(〇)(η = 5)。图5为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法的试验条件优化的一个优选实施例的结果图；其中:Α. 24小时和48小时的测试结果，48小时是有效的，阿霉素0. 2 μ g/ml (□) 和1 μ g/ml _，载体(■).与载体相比的P值Γ )，与0. 2 μ g/ml药物相比的P值(#)，* /#p<0. 05,**p<0.01, ***/### <0. 001 (η = 5) ；B.细胞数量与荧光读数之间的线性关系。图6为验证基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法实验条件最优的一个优选实施例的结果图；其中验证基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法实验条件最优潜在抗肿瘤化合物 (100 μ Μ)在24小时㈧和48小时(B、C)的药物筛选实验.48小时药物有作用效果，并且实验可重复(B、C) (η = 3)。图7为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制敏感性之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中Α荧光分析法；B MTT比色法。抗肿瘤化合物50 μ M (Ο),10 μ M ( ) and 2 μ M (■);荧光分析法更敏感(η = 5)。图8为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的半数抑制浓度IC50之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中戊烷脒的IC50分别是A.荧光分析法25. 35 士 3. 58μΜ;Β.ΜΤΤ比色法 22. 12 士 1. 33 μ Μ，数值相近(η = 5)。具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的担载蛋白的组织工程纤维支架及其制备和体外释放实验实施作详细说明以下实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例一高效稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的U20S细胞株(U20S-EGFP细胞株)的建立1.含neo抗性的EGFP质粒转染U20S细胞1)U20S细胞连续传代处理2-3次，以使细胞维持良好生长状态，准备铺板；2)铺24孔板，一个90%满的IOcm皿细胞可铺24孔，按每孔500 μ L培养基的量铺于24孔细胞培养板中。每隔20min观察细胞贴壁情况，晃动平板，让细胞尽量均勻地铺于孔中；3)5% C02，37°C孵育l_2h，待细胞贴壁后，准备进行转染24孔板的1个孔；4)转染步骤按照 DNA 浓度 0. 4 μ g/mL、PEI 浓度 0. 8 μ g/mL,溶于 200 μ LDMEM 基础培养基中，配置成转染液；室温下孵育10分钟后，加300 μ LDMEM基础培养基至转染液中， 混勻，将本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞，其特征在于，所述的细胞为Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ细胞，保藏号为：ＣＧＭＣＣ ＮＯ：４７８７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李大伟，D·柯伊拉腊，徐维果，武正华，吴凤娟，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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