晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的ER表达情况。借助于ISET技术分离富集CTCs，依靠细胞免疫荧光技术鉴定CTCs，克服了单纯ISET技术鉴定CTCs存在的困难和单纯免疫学检测技术存在的假阴性。该技术设备要求不高，方法易掌握，并能实时监测。通过该技术方法，不用取材乳腺癌组织即可检测到晚期乳腺癌患者ER表达情况。

Detection of ER gene in peripheral blood circulating tumor cells in patients with advanced breast cancer

The invention discloses a detection method for patients with advanced breast cancer circulating tumor cells in peripheral blood of ER gene: by using membrane filtration and separation device for patients with advanced breast cancer in peripheral blood CTC cells; using immunofluorescence techniques to identify patients with advanced breast cancer circulating tumor cells; using cell block fabrication technology of thin layer and then through the section; circulating tumor cells in blood ER immunohistochemical technique in patients with advanced breast cancer peripheral expression. With the help of ISET technology, CTCs was separated and enriched, and CTCs was identified by immunofluorescence technique, which overcame the difficulty of identifying CTCs by using ISET alone and the false negative result of pure immunological detection. The technical equipment requirements are not high, the method is easy to grasp, and real-time monitoring. By using this method, the expression of ER in the patients with advanced breast cancer can be detected without breast cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测ER基因的新方法，尤其是通过外周血检测晚期乳腺癌患者ER基因的方法。
技术介绍
目前作为预后因子纳入治疗指南中的雌激素受体(Estrogenreceptor，ER)已经成为制定乳腺癌患者内分泌治疗方案时最重要的指标。现有的乳腺癌ER的检测需要通过手术或穿刺活检等方式获得原发瘤或转移瘤的肿瘤组织标本，然而不是每一位患者都能获得肿瘤组织样本，而且不能在治疗过程中进行连续的检测，限制了其成为有效的疗效监测指标。但脱落入血的循环肿瘤细胞可以给我们提供潜在的实时肿瘤标本，其突变状态同样可以用于指导治疗。循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。目前CTCs检测的主要方法包括依赖肿瘤相关标志物检测的免疫学检测技术及基于形态学富集的膜过滤技术(Isolatingbysizeofepithelialtumorcells，ISET)。前者是基于细胞表面表达不同抗原标志，将针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加磁场筛选富集CTCs。该技术的优势在于特异度较高，已有商品化的半自动检测设备(CellSearch)；但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异，利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉，分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准，该富集技术特异性相对较差。
技术实现思路
为了克服传统循环肿瘤细胞检测技术及晚期乳腺癌患者不适宜组织标本取材--进而无法评估患者ER状态的不足，本专利技术专利提供一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的ER表达情况。该方法具体步骤如下：一、利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：1、采集晚期乳腺癌症患者外周血：肘正中静脉10ml，均分为2管编写相同编号后，分别命名为实验1组和实验2组；2、将2管外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；3、利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；4、过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器，PBS冲洗2-3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜上。二、利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：1、向实验1组分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；2、PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入washbuffer300μl，封闭30min；3、加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以washbuffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；4、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以washbuffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；5、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst300μl，洗染细胞核5min；6、PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；7、荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；如观察到CTC则继续进行下一步检测，否则停止检测。三、运用细胞蜡块技术制作CTC细胞蜡块：1、从过滤装置中取下实验2组相同血样编号的滤器，打开并移走滤器上口，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；2、制作CTC细胞蜡块；A、脱色：将上述载玻片上的滤膜取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀；B、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；C、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h。D、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块。E、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2-4μm的薄层切片。四、通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的ER表达情况：1.烤片：CTC蜡块薄层切片在60℃恒温箱中烤片2小时；2.脱蜡：切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟；3.水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟(视室内温度情况稍作调整)：自来水、蒸馏水冲洗；4.抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；5.蒸馏水冲洗；6.去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；7.蒸馏水冲洗；8.PBS浸洗5次各1.5分钟；9.滴加ER一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；10.滴加二抗；11.37℃水浴锅中孵育20分钟；12.PBS浸洗5次各1.5分钟；13.显微镜下控制，DAB显色；14.自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；15.自来水冲洗5分钟；16.75％-95％-100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；17.细胞病理学专家阅片，判读ER表达情况。利用细胞免疫荧光技术鉴定外周血循环肿瘤细胞步骤中所述的膜过滤装置：包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检测方法，其特征在于，利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的ER表达情况。

【技术特征摘要】
1.一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检测方法，其特征在
于，利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鉴定晚期
乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而
检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的ER表达情况。
2.根据权利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检
测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、
废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)
和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上
部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通
至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。
3.根据权利要求2所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检
测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载
滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上
口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。
4.根据权利要求3所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检
测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口
径为10微米的滤孔(10)。
5.根据权利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检
测方法，其特征在于，所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外
周血循环肿瘤细胞，步骤如下：
1)采集晚期乳腺癌症患者外周血：肘正中静脉5ml；
2)将外周血样进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液

\t成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA，稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10
分钟；
3)利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预
处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自
然过滤；
4)过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器(3)，PBS冲洗2-3次，
外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上。
6.根据权利要求1所述的晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞ER基因的检
测方法，其特征在于，所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞，
步骤如下：
1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入
Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；
2)PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入washbuffer300μl，封
闭30min；
3)加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，三种一抗均以wash
buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；
4)Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300
μl，三种二抗均以w...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙萍，戴亮，李胜，王振丹，
申请(专利权)人：山东省药物研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37