The invention discloses a method for detecting an advanced breast cancer circulating tumor cells in peripheral blood of 2 Her gene: by using membrane filtration and separation device for patients with advanced breast cancer in peripheral blood CTC cells by immunofluorescence technique; identification of circulating tumor cells in advanced breast cancer patients with peripheral blood cells; using wax block technology production of thin slices; and then through Her immunohistochemical technique in patients with advanced breast cancer circulating tumor cells in peripheral blood of 2 expression. The invention uses ISET technology to separate and enrich CTCs, and identify CTCs by cellular immunofluorescence technology. It overcomes the difficulties of ISET identification by CTCs and false negative in immunological detection technology. At the same time, the requirements of the equipment are not high, the method is easy to master, and can be monitored in real time. By this method, not from breast cancer can be detected in patients with advanced breast cancer Her 2 expression.
【技术实现步骤摘要】
晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞Her-2基因的检测方法
本专利技术涉及一种检测Her-2基因的新方法,尤其是通过外周血检测晚期乳腺癌患者Her-2基因的方法。
技术介绍
酪氨酸激酶-人类表皮生长因子受体2(Her-2,又名Her2/neu、c-erbB-2)在20%-30%的乳腺癌患者中有基因的扩增和蛋白的过度表达。Her-2阳性的乳腺癌浸润性强,无病生存期短,预后差。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,适用于Her-2过度表达的乳腺癌。由于只有Her-2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者用曲妥珠单抗治疗才有效,因此正确检测和评定乳腺癌的Her-2状态至关重要。目前通常使用的Her-2检测方法有两种。一种是免疫组织化学方法,通过检测乳腺癌组织标本中的Her-2蛋白表达情况判定Her-2状态。该方法被认为是Her-2检测的金标准,但有研究证实该方法无法区分Her-2蛋白为中度阳性的患者是否存在Her-2基因的扩增。另外一种方法是基于检测Her-2基因扩增水平的荧光原位杂交法(FISH),特异性更高,目前临床应用亦越来越多。这两种检测方法均是以乳腺癌组织为检测对象,尤其适用于早期乳腺癌行手术切除治疗的患者。但对于部分缺乏手术指证或存在手术禁忌症的乳腺癌患者(如晚期乳腺癌患者),由于肿瘤组织无法切除,细针穿刺组织又容易造成肿瘤播散,Her-2状态评估变得困难。循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell,CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞,它存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中,其检测对于评估肿瘤患者 ...
【技术保护点】
一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞Her‑2基因非诊断目的的检测方法,其特征在于,检测方法如下:利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC;鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞;运用细胞蜡块技术制作薄层切片;进而检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的Her‑2表达情况;所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC,步骤如下:1)采集晚期乳腺癌症患者外周血:肘正中静脉5ml;2)将外周血样进行预处理:将采集的外周血样10倍稀释,稀释液成分:1mmol/l EDTA+0.1%BSA,稀释后用4%多聚甲醛固定外周血样10分钟;3)利用膜过滤装置分离外周血样,富集外周血循环肿瘤细胞:将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中,使其依靠重力自然过滤;4)过滤结束后,从膜过滤装置中取下滤器(3),PBS冲洗2‑3次,外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上;所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞,步骤如下:1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl,固定、穿孔15min;2)PBS漂洗3次,每次5分钟,之后 ...
【技术特征摘要】
1.一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞Her-2基因非诊断目的的检测方法,其特征在于,检测方法如下:利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC;鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞;运用细胞蜡块技术制作薄层切片;进而检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的Her-2表达情况;所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC,步骤如下:1)采集晚期乳腺癌症患者外周血:肘正中静脉5ml;2)将外周血样进行预处理:将采集的外周血样10倍稀释,稀释液成分:1mmol/lEDTA+0.1%BSA,稀释后用4%多聚甲醛固定外周血样10分钟;3)利用膜过滤装置分离外周血样,富集外周血循环肿瘤细胞:将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中,使其依靠重力自然过滤;4)过滤结束后,从膜过滤装置中取下滤器(3),PBS冲洗2-3次,外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上;所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞,步骤如下:1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl,固定、穿孔15min;2)PBS漂洗3次,每次5分钟,之后加入washbuffer300μl,封闭30min;3)加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl,两种一抗均以washbuffer稀释,混匀后的终浓度为1:250,室温下孵育45min;4)Washbuffer洗涤3次,每次5分钟,之后加入二抗混悬液300μl,两种二抗均以washbuffer稀释,混匀后的终浓度为1:500,室温下避光孵育30min;5)Washbuffer洗涤3次,每次5分钟,之后加入Hoechst300μl,洗染细胞核5min;6)PBS漂洗2次,每次3分钟,之后取出滤膜(7)置于载玻片上,滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片;7)荧光显微镜下2h内观察结果,拍照、记录CTC情况,确定是否存在CTC;所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片,步骤如下:1)外周血过滤后,从过滤装置中取下滤器(3),打开并移走滤器上口(6),将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中,染色2min,PBS缓冲液冲洗干净,取下滤膜(7),放置在载玻片上,适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC;2)制作CTC细胞蜡块:A、脱色:将带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下,置于95%酒精与100%二甲苯体积比1:1混匀的脱色液中浸泡4-6小时,脱去CTC染色液;B、包裹:浸泡结束后取出滤膜...
【专利技术属性】
技术研发人员:高杰,庞恺,李胜,孙萍,王振丹,
申请(专利权)人:山东省药物研究院,
类型:发明
国别省市:山东,37
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