一种海洋细菌基因LfliZ及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海洋细菌基因LfliZ及其应用。一种海洋细菌基因LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术还涉及该基因LfliZ表达的重组蛋白LfliZ及在制备2′,3′‑环形核苷单磷酸中的应用。本发明专利技术克隆的基因LfliZ编码的蛋白LfliZ能够在大肠杆菌胞内结合四种2′,3′‑环形核苷单磷酸。通过提纯重组LfliZ蛋白，可以实现从大肠杆菌中同时直接提取四种2',3'‑环形核苷单磷酸。经计算每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2',3'‑环形核苷单磷酸，有较好的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海洋细菌基因LfliZ及其应用，属于生物技术

技术介绍
海洋微生物数量巨大，新种资源极其丰富，也存在大量新基因资源。随着技术的进步，海洋微生物资源的开发成为各国研究的焦点。但是，由于采样和培养等困难，目前对海洋微生物资源及其基因资源的开发利用还很有限。发现海洋中新基因并研究其功能，对开发和利用海洋微生物基因资源具有重要意义。环形核苷酸是细胞内重要的第二信使，参与细胞内多种信号转导途径的调控。现已知发现的第二信使包括环形腺苷单磷酸(3′,5′-cAMP)、环形鸟苷单磷酸(3′,5′-cGMP)、环形胞苷单磷酸(3′,5′-cCMP)、环形尿苷单磷酸(3′,5′-cUMP)、环形二鸟苷酸(c-di-GMP)，环形二腺苷酸(c-di-AMP)及环形鸟苷腺苷酸(cGAMP)。除了上述已发现的环形核苷酸类第二信使外，在2009年埃德温(Edwin)等人还首次在人的肾脏细胞中发现了腺苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cAMP)，随后人们又在哺乳动物的大脑等组织细胞中发现了腺苷-2',3'-环形单磷酸的存在。科研人员还从植物细胞中检测到腺苷-2',3'-环形单磷酸和鸟苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cGMP)，从一株荧光假单胞菌中检测到胞苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cCMP)和尿苷-2',3'-环形单磷酸(2′,3′-cUMP)的存在。现有的研究结果表明，这四种2′,3′-环形核苷单磷酸很可能代表了另外一类新型的生物细胞第二信使。由于2′,3′-环形核苷单磷酸吸引了越来越多的关注，其在科学研究和医学上的需求也日益增多。目前2′,3′-环形核苷单磷酸的制备均采用化学合成的方法，尚未有生物制备方法。化学合成法生产2′,3′-环形核苷单磷酸，产量低，价格高，在一定程度上限制了其开发应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种海洋细菌基因LfliZ及利用其重组LfliZ蛋白快速制备四种2′,3′-环形核苷单磷酸(腺苷-2',3'-环形单磷酸、鸟苷-2',3'-环形单磷酸、胞苷-2',3'-环形单磷酸和尿苷-2',3'-环形单磷酸)的方法。本专利技术技术方案如下：一种海洋细菌基因LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述海洋细菌基因LfliZ表达的重组蛋白LfliZ，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。一种重组载体，在质粒中插入含有上述海洋细菌基因LfliZ。根据本专利技术优选的，所述的质粒为pET-22b(+)质粒。一种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。根据本专利技术优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选的，所述的宿主细胞为 大肠杆菌BL21(DE3)。上述海洋细菌基因LfliZ在制备2′,3′-环形核苷单磷酸中的应用。上述应用，步骤如下：(1)制备核酸序列如SEQ ID No.1所示的海洋细菌基因LfliZ；(2)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体；(3)构建含有步骤(2)所示重组载体的重组细胞；(4)发酵培养上述重组细胞，经提取纯化，制得2',3'-环形核苷单磷酸。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)的重组载体采用的质粒为pET-22b(+)质粒；所述步骤(3)中的重组细胞采用的宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，发酵培养步骤如下：先在35～38℃、150～200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm时的吸光度为0.8；然后在18～22℃、100～140rpm继续培养25～35min；然后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至浓度为0.1mM，继续诱导培养22～25小时；所述发酵培养采用的培养基为LB液体培养基，每升组分如下：10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，蒸馏水定容至1L，pH 8.0。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中的提取纯化，步骤如下：(i)将发酵液经固液分离，取菌体，破碎菌体，固液分离，取上清液，经镍柱亲和层析，洗脱后，制得目的蛋白LfliZ溶液；(ii)将步骤(i)制得的目的蛋白LfliZ溶液在-1～2℃静置2.5～3.5天，离心，取上清液，经超滤，制得2',3'-环形核苷单磷酸粗提液；(iii)将步骤(ii)制得的2',3'-环形核苷单磷酸粗提液经C18反向色谱柱进行高效液相色谱纯化，分别制得四种2',3'-环形核苷单磷酸。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(i)中采用镍柱亲和层析，步骤如下：将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，用20mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10mL的洗脱缓冲液洗脱，制得重组蛋白LfliZ溶液；所述裂解缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH8.0；所述冲洗缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、50mM咪唑，pH8.0；所述洗脱缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(ii)中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤管超滤。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(iii)中C18反向色谱柱进行高效液相分离的分离程序为：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％； 流速为10ml/min，检测波长为254nm；流动相为：A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0；B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混合。有益效果本专利技术克隆的基因LfliZ编码的蛋白LfliZ能够在大肠杆菌胞内结合四种2′,3′-环形核苷单磷酸，即腺苷-2',3'-环形单磷酸、鸟苷-2',3'-环形单磷酸、胞苷-2',3'-环形单磷酸和尿苷-2',3'-环形单磷酸。通过提纯重组LfliZ蛋白，可以实现从大肠杆菌中同时直接提取四种2',3'-环形核苷单磷酸。经计算每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2',3'-环形核苷单磷酸，有较好的应用潜力。附图说明图1、通过PCR克隆的LfliZ基因的琼脂糖凝胶电泳图；图中：M、核酸分子量标记(marker)；LfliZ、LfliZ基因；图2、镍柱亲和层析纯化的重组蛋白LfliZ的SDS-PAGE电泳图；图中：M、蛋白质分子量标记(marker)；LfliZ、镍柱亲和层析纯化后的重组LfliZ蛋白；图3、提取含4种2′,3′-环形核苷单磷酸粗提液的HPLC分析；图4、纯化得到的2′,3′-cCMP液相色谱和质谱分析；(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cCMP；(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cCMP，图谱显示提纯的2′,3′-cCMP的质荷比为306.0491(z＝1),与理论值306.0486极为相符；(c)，2′,3′-cCMP结构示意图；图5、液相色谱，质谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP；(a)，液相色谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP；(b)，一级质谱分析纯化得到的2′,3′-cUMP，图谱显示提纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋细菌基因LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种海洋细菌基因LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述海洋细菌基因LfliZ表达的重组蛋白LfliZ，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种重组载体，在质粒中插入含有权利要求1所述海洋细菌基因LfliZ。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pET-22b(+)质粒。5.一种重组细胞，将权利要求3所述重组载体转化入宿主细胞中获得。6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。7.权利要求1所述海洋细菌基因LfliZ在制备2′,3′-环形核苷单磷酸中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：(1)制备核酸序列如SEQ ID No.1所示的海洋细菌基因LfliZ；(2)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体；(3)构建含有步骤(2)所示重组载体的重组细胞；(4)发酵培养上述重组细胞，经提取纯化，制得2',3'-环形核苷单磷酸。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)的重组载体采用的质粒为pET-22b(+)质粒；所述步骤(3)中的重组细胞采用的宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，发酵培养步骤如下：先在35～38℃、150～200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm时的吸光度为0.8；然后在18～22℃、100～140rpm继续培养25～35min；然后加入IPTG至浓度为0.1mM，继续诱导培养22～25小时；所述发酵培养采用的培养基为LB液体培养基，每升组分如下：10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，蒸馏水定容至1L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀兰，张玉忠，刘昂，宋晓妍，于洋，李平一，张熙颖，石梅，解彬彬，苏海楠，秦启龙，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37