本发明专利技术公开了一种新的整合子In1289，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药非伤寒沙门氏菌EC7328的基因组中发现的。因此本发明专利技术的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与大肠埃希氏菌耐药性密切相关的整合子。
技术介绍
大肠埃希氏菌，通常称为大肠杆菌，是人体正常肠道菌群的组成部分，一般在肠道为非致病菌，但也有一些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻或肠外感染。致病作用主要是侵袭力、内毒素和肠毒素。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、污染水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命；另外，随着广谱抗生素在临床的广泛使用，在医院出现了产超广谱β内酰胺酶的大肠埃希氏菌流行，给医院造成了很大的困扰，严重威胁病人的健康安全。大肠埃希氏菌的耐药问题已成为影响人类健康的一个非常重要因素。整合子(integron)是一种可以通过捕获的外源基因，并将其转化为功能基因的DNA片段，定位于染色体、转座子或质粒上，并可在其间流动。主要见于革兰阴性菌，以I类整合子的发现在革兰阴性菌中分布最广。I类整合子的基本结构由3部分组成，两端是高度保守序列，分别称作5’保守端(5’-CS)和3’保守端(3’-CS)，5’-CS长约1.4kb，3’-CS长约2kb，5’-CS和3’-CS之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个基因盒组成，基因盒一般含抗菌药物耐药基因。整合子是一种可移动的基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引起耐药基因的高效、快速转移，造成同种或不同菌种之间的扩散，从而表达对不同抗生素的多重耐药性。深入研究大肠埃希氏菌耐药机制特别对有关整合子的研究，可加强对感染菌株的流行病学的了解，有利于抗菌药物的合理使用和新抗生素药物的开发；同时，加强抗菌药物的合理应用，可减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多药耐药菌株的发生。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In1289，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子含有dfrA27基因盒、arr-3基因盒、catB3基因盒和aacA4基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗生素药物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素、氯霉素类抗生素以及利福平类抗生素。常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰(SA)、以及复方新诺明(甲氧苄啶+磺胺甲恶唑)。常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。常见的利福平类抗生素包括：利福平、利福喷汀。本专利技术的整合子是通过以下方法获得的：(1)在台州市立医院ICU病人痰液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星耐药的细菌。(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希氏菌将其命名为EC7328。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著耐药性。(3)将EC7328菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。(4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段最后长度为4,324bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本专利技术还提供了一种含有整合子In1289序列的重组质粒。所述质粒包含整合子In1289序列。在本专利技术的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子In1289序列和pET32a载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知的常规方法。本专利技术还提供了一种含有整合子In1289的接合菌株。为了研究整合子的耐药性，本专利技术利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子In1289的功能，将EC7328菌株与E.coli J53 AzR(对叠氮化钠耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钠(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐药性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替：妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、复方新诺明、SMZ、利福平。本专利技术还提供了一种含有整合子In1289的重组菌株。为进一步证实上述接合菌株的抗性来源于EC7328菌株中的整合子，本专利技术将该整合子In1289克隆入pET32a载体中，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E.coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆(含有pET32a-整合子的细菌)。将阳性克隆做药敏试验，结果显示EC7328菌株中的整合子In1289可以使重组E.coli JM109菌株对以下药物耐药：阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素、利福平。本专利技术的优点和有益效果：(1)本专利技术首次发现了序列为SEQ ID NO.1的包括多种耐药基因盒的整合子In1289，该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。(2)本专利技术整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。附图说明图1为本专利技术的整合子In1289的结构示意图。具体的实施方式下面结合具体的实施例进一步说明本专利技术，本专利技术的实施例仅用于解释本专利技术，并不意味着限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1整合子In1289的鉴定1、EC7328菌株的分离和鉴定1.1材料细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有复方新诺明(30μg)、氯霉素(30μg)和利福平(5μg)。1.2方法仪器鉴定：将台州市立医院ICU病人痰液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO2孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In1289。
【技术特征摘要】
1.一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In1289。2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的载体质粒为pET32a载体。4.一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述接合细菌是由EC7328菌株与E.coliJ53 AzR菌株制备。5.一种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述重组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli JM109菌株中制备而成。6.权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在台州市立医院ICU病人痰液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星耐药的细菌；(2)将步骤(1)分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法，同时补充药敏纸片进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希菌，命名为EC7328；(3)将EC7328菌株培养扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：王冬国，周冬生，陈佳玉，
申请(专利权)人：王冬国，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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