本发明专利技术提出一种基因psa D，所述基因psa D的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。由所述基因psa D编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术提供了基因psa D的核苷酸序列；通过异源表达克隆到的基因，利用大肠杆菌高效产生α‑酮戊二酸，通过异源表达克隆得到的基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种促进α-酮戊二酸分泌的基因及其应用。
技术介绍
许多有机酸是微生物在生长代谢过程中中间产物或胞外产物，能够大量分泌的有机酸包括琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富马酸和草酸等。微生物分泌有机酸在农业中最常见的作用为促进土壤中难溶盐的溶解，为植物提供营养，其中，效果最明显的为促进土壤难溶磷的溶解，可提高土壤中磷肥利用率。α-酮戊二酸分子式为C5H6O5，是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，可用于作为膳食补充品出售，作为运动营养饮料的成分，作为测肝功能有机中间体，具有降低术后患者和长期病人的机体损耗，在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体，同时具有抗氰作用。微生物的溶磷机理虽然分为5种：有机酸、氢质子(NH4-N供应)、磷酸酶(蛋白质)、螯合作用和氧化还原，但，大多数效果明显的微生物都是通过产生有机酸溶解无机磷，有机酸能与铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷(唐超西,龚明波，2012，中国农业科学,45(18):3792-3800.)。关于溶磷相关基因研究以细菌为主，其主要机制是将葡萄糖直接氧化产生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶(GDH)和协同因子吡咯喹啉奎宁(PQQ)完成(Goldstein AH，1999，FEMS Microbiology Ecology,30(4):295-300.)。目前关于真菌溶磷相关
基因的克隆也有报道，主要是以黑曲霉和草酸青霉为主，但其数量非常少，主要机制也不是很明确，也有报道从草酸青霉中克隆到的基因编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中表达，分泌苹果酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、草酸等有机酸从而使难溶磷溶解(Gong MB,2014,Canadian Journal of Microbiology,60:1‐5)。目前，在ncbi数据库中发布了真菌Aspergillus niger CBS 513.88(XM_001398218.2)、Aspergillus niger clone AXAS45-D05(AC253947.1)、和Aspergillus niger clone AXAS161-N13(AC253846.1)的全基因组序列，与本专利技术序列同源性都为99％，该基因编码的蛋白与Aspergillus kawachii IFO 4308以及Aspergillus terreus NIH2624等编码的蛋白polyubiquitin的蛋白同源性为99％，但未报到其具有产生α-酮戊二酸的功能。其它报道的都为假定蛋白，没有进行功能分析。
技术实现思路
针对本领域存在的不足之处，本专利技术的目的是提出一种促进分泌丙酮酸的基因psa D。本专利技术的另一目的是提出所述基因psa D的提取方法。本专利技术的第三个目的是提出所述基因psa D的应用。实现本专利技术上述目的技术方案为：一种基因psa D，所述基因psa D的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。由所述的基因psa D编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本专利技术提出的基因psa D的提取方法，包括步骤：1)在难溶磷无机盐培养基上培养黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)，从培养的黑曲霉菌H1基因组中提取总RNA，再从总RNA中纯化出mRNA，用引物5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:A or
C or G扩增，合成cDNA第一链；2)cDNA第一链以5'-AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3为引物，通过LD-PCR合成双链cDNA，3)将cDNA序列连接到pBluescript SK II(+)上，连接产物电转化到大肠杆菌上，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子；4)筛选出的转化子进行转接培养，筛选克隆子进行测序分析，得到全长为1205bp的cDNA序列，利用DNAMAN分析其基因开放阅读框为305个氨基酸。其中，步骤1)可用RNAiso plus试剂盒提取总RNA，用Oligotex mRNA Mini Kit试剂盒纯化mRNA。步骤2)PCR反应条件可以为：95℃预变性1min；95℃变性15s；65℃退火30s,68℃延伸6min，30cycles 4℃forever。其中，步骤3)所述电转化的条件为：每50μL大肠杆菌感受态细胞施加电量25μF，电击的电压为1.5KV。含有本专利技术所述基因的载体。其中，所述载体可以为表达载体pBluescript SK II(+)。含有本专利技术所述基因的工程菌。进一步地，所述工程菌为大肠杆菌。本专利技术还提出基因psa D在生产α-酮戊二酸中的应用。以及，基因psa D在溶解无机难溶磷中的应用。本专利技术从黑曲霉H1中克隆溶磷基因，其编码的蛋白导入大肠杆菌中，在难溶磷无机盐培养基中培养36h时，促进大肠杆菌分泌α-酮戊二酸，含量达到2248.4μg/mL，溶液中pH值从6.45降到3.26，释放的可溶磷含量为0.19mg/mL。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术首先提供了溶磷基因psa D的核苷酸序列；2、本专利技术通过异源表达克隆到的基因，利用大肠杆菌高效产生
α-酮戊二酸；3、本专利技术通过异源表达克隆得到的基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。附图说明图1为实施例1黑曲霉菌H1在难溶磷无机盐培养基上培养3d的形态。图2为实施例1黑曲霉菌H1的总RNA图。图3为实施例2中携带溶磷基因的克隆子。图4为工程菌培养不同溶液pH值的变化。图5为工程菌培养不同溶液可溶磷含量的变化。图6为本专利技术实施例5生产α-酮戊二酸的液相色谱图。图7为2000mg/L的丙酮酸标准样品液相色谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。本领域技术人员应当知晓，本专利技术的范围不仅限于特定的实施方案，在不脱离本专利技术的精神下可以进行各种修饰和改变。实施例中，大肠杆菌菌种购自生工生物工程(上海)股份有限公司。如未特别说明，具体实施方式中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。实施例1黑曲霉菌的cDNA全长文库构建实验所用菌株黑曲霉H1为中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业菌种保藏中心从土壤样品中筛选，在难溶磷无机盐培养基上培养3d，取0.2g左右新鲜菌丝(如图1)，液氮研磨，利用RNAiso plus试剂盒提取总RNA，再用Oligotex mRNA Mini Kit试剂盒从总RNA中纯化出mRNA。每个离心管加入2μL纯化的mRNA，1μL浓度为12μM的3’SMART CDS
PrimerIIA(5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:A or C or G))，最后用RNase Free H2O补足至终体积为4.5μL，使溶液充分混匀后离心，72℃水浴3min，立即转到42℃水浴2min，立即向每个离心管中加入5.5μL混合液(表1)，充分混匀后离心，置于42℃水浴90min，立即放置冰上，cDNA第一链合成，产物立即进行LD-PCR或-20℃保存备用。表1第一链合成混合液以2μL第一链cDNA产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因psa D，其特征在于，所述基因psa D的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种基因psa D，其特征在于，所述基因psa D的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种由权利要求1所述的基因psa D编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.权利要求1所述基因psa D的提取方法，其特征在于，包括步骤：1)在难溶磷无机盐培养基上培养黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)，从培养的黑曲霉菌H1基因组中提取总RNA，再从总RNA中纯化出mRNA，用引物5'-(GA)10ACTAGTCTCGAG(T)18V-3’(V:A or C or G扩增，合成cDNA第一链；2)cDNA第一链以5'-AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3为引物，通过LD-PCR合成...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚明波，顾金刚，李世贵，马晓彤，邓晖，张晓霞，张瑞颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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