本发明专利技术通过随机突变全局转录因子σ70编码基因rpoD筛选具有高丁醇耐受性的大肠杆菌菌株，属于生物工程技术领域。本发明专利技术采用随机突变法构建全局转录因子σ70编码基因rpoD的突变文库，筛选获得了一株携带σ70突变基因rpoDM2的大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8，可耐受2％(v/v)丁醇。本发明专利技术为具有高丁醇耐受性微生物菌株的构建提供了理论依据和有效方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种随机突变全局转录因子σ70编码基因rpoD筛选具有高丁醇耐受性的大肠杆菌菌株，属于生物工程
技术介绍
微生物菌株在生物能源制备及非水相生物催化等领域具有广泛的应用，但有机溶剂对微生物细胞的生长和生理功能具有抑制作用，这严重影响了微生物菌株在工业领域中的应用。因此，提高微生物细胞的有机溶剂耐受性具有重要的应用价值。全局转录因子可通过对细胞基因组中上千个基因的转录水平进行特异性调控。通过全局转录因子的突变，可以关闭或强化一些基因的转录，从而获得具有特定目标表型的菌株。2012年，Zhang等对全局转录因子cAMP受体蛋白(CRP)进行随机突变得到能够耐受1.2％(v/v)丁醇的大肠杆菌。2010年，Liu等通过对酿酒酵母中全局转录因子spt15进行突变，提高了酵母菌株对木糖的耐受及利用率。因此，通过对全局转录因子突变，可以对微生物的自身代谢进行优化，从而获得理想的细胞表型。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对全局转录因子σ70编码基因rpoD进行随机突变，提高大肠杆菌的丁醇耐受性。该方法操作简单，能有效地提高大肠杆菌的有机溶剂耐受性。本专利技术的技术方案：对pHACM质粒上的rpoD基因(编码σ70因子)进行突变，转化于大肠杆菌E.coli JM109中，筛选获得携带有σ70突变基因rpoDM2的大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8，该菌株能够耐受2％(v/v)的丁醇。一种通过随机突变全局转录因子σ70编码基因rpoD筛选丁醇耐受型大肠杆菌的方法，其主要步骤为：(1)以携带有野生型rpoD基因的pHACM质粒为模板，全质粒扩增构建σ70基因突变文库；(2)转化大肠杆菌进行高通量筛选，以丁醇为有机溶剂压力，采用24深孔板筛选高丁醇耐受菌株。(3)从一轮筛选中，选取丁醇耐受性最高的重组菌，提取质粒，并以该σ70突变基因为模板再次进行随机突变，构建σ70基因突变文库。(4)进行二轮筛选，筛选获得具有最高丁醇耐受性的重组菌E.coli JM109/pHACMB8，提取质粒并对突变基因进行测序，即为σ70突变基因rpoDM2。运用上述方法获得的可显著提高大肠杆菌丁醇耐受性的σ70突变基因rpoDM2，其特征为：(1)该σ70突变基因rpoDM2，包含三个突变位点：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln。携带该σ70突变基因rpoDM2的大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8能够耐受2％(v/v)丁醇，而野生型大肠杆菌在0.1％(v/v)的丁醇浓度下就停止生长。野生型σ70基因rpoD的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；σ70突变基因rpoDM2的氨基酸序列为：SEQ ID NO：2。本专利技术的有益效果：1.通过对全局转录因子σ70编码基因rpoD进行随机突变，经过高通量筛选，在较短时间内获得了丁醇耐受性显著提高的大肠杆菌菌株。为改造微生物菌株的有机溶剂耐受性提供了理论依据和有效方法。2.在σ70突变文库中，使用24深孔板代替摇瓶筛选，即提高了实验效率，又节约了实验成本。附图说明图1第一轮σ70突变文库的筛选。图2第二轮σ70突变文库的筛选。具体实施方式实施例1 σ70随机突变文库的构建利用随机突变试剂盒(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)，以携带有rpoD基因的质粒pHACM为模板，以p-rpoD-F、p-rpoD-R为引物对rpoD(编码σ70转录因子)进行随机突变。其中，p-rpoD-F、p-rpoD-R引物序列为：p-rpoD-F：5'-AACCTAGGAGCTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAGAGC-3'p-rpoD-R：5'-TGGAAGCTTTAACGCCTGATCCGGCCTACCGATTA-3'。易错PCR反应体系如下：PCR条件为：95℃5min，95℃30s，57℃1min，72℃2min，反应30个循环后72℃再延伸10min。对突变后的rpoD片段经凝胶电泳后切胶回收，以纯化后的rpoD片段为引物对pHACM进行全质粒大引物PCR。PCR体系如下：PCR条件为：68℃5min，95℃1min，95℃30s，55℃20s，68℃6min，反应30个循环后68℃再延伸20min。反应结束后向PCR产物中加入Dpn I酶消化模板质粒，PCR产物经凝胶电泳后切胶回收。回收后的质粒按照常规热激方法，转入E.coli JM109感受态细胞中，同时将未突变的质粒转化E.coli JM109感受态细胞后获得的菌株作为对照菌。37℃后培养1.5h后涂布于氯霉素固体平板中培养至单菌落出现，即获得rpoD基因的随机突变文库。实施例2 rpoD随机突变文库的丁醇耐受性筛选第一轮筛选：为获得具有较高丁醇耐受的大肠杆菌菌株，将构建的rpoD随机突变文库中的单菌落接种于含有LB/Cm液体培养基的24深孔板中，当OD660≈0.2时，向培养基中加入0.5％(v/v)丁醇，继续培养8h后分别测定菌体在OD660时的浓度，见图1。选取OD660较高的10株菌株，分别命名为JM109/pHACMD1-D10(以下简称D1-D10)，对这10株菌在丁醇浓度以0.1％(v/v)梯度递增的液体培养基中培养，继续进行复筛，发现D3在1.2％(v/v)丁醇浓度下，OD660达到了0.76，其他9株重组菌和对照菌株OD660均低于0.60，见表1。提取菌株D3的质粒，经测序发现rpoDD3基因中两个碱基发生了突变，相应的氨基酸突变为Ile41Leu，Pro97Gln。表1第一轮筛选获得的丁醇耐受菌株在1.2％(v/v)丁醇浓度下的生长情况第二轮筛选：为进一步提高大肠杆菌的丁醇耐受性，以携带有σ70突变基因rpoDD3的质粒为模板，按照实施例1中的方法再次构建随机突变文库，并按照一轮筛选的方法进行二轮筛选，如图2所示，在483个重组菌中有8株菌的OD660>2，明显高于其他重组菌。将这8株菌分别命名为JM109/pHACMB1-B8(以 下简称B1-B8)。对这8株菌在丁醇浓度0.1％(v/v)梯度递增的液体培养基中培养继续进行复筛，发现B8在1.2％(v/v)丁醇浓度下OD660达到了1.43，其他菌株OD660<1.0，见表2。同时提取菌株B8的质粒进行测序，发现在rpoDD3氨基酸突变的基础上，又增加了Glu57Asp这个位点的突变，即现在所得B8菌株所携带的σ70突变基因rpoDM2的突变位点为：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln，如SEQ ID NO：2所示。表2第二轮筛选获得的丁醇耐受菌株在1.2％(v/v)丁醇浓度下的生长情况实施案例3菌株JM109/pHACMB8的丁醇耐受浓度实验为了进一步测定丁醇耐受菌株JM109/pHACMB8对丁醇的极限耐受浓度。我们将携带有野生型rpoD基因的对照菌株和丁醇耐受菌株JM109/pHACMB8分别在1.2-2.2％(v/v)丁醇浓度递增的培养基中，37℃培养8h，测定各丁醇浓度下菌株的OD660值。如表3所示，当丁醇浓度达到2.0％(v/v)时，JM109/pHACMB8的OD660达到0本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用随机突变全局转录因子σ70编码基因rpoD的方法，获得一种显著提高大肠杆菌丁醇耐受性的σ70突变基因rpoDM2，其特征在于：rpoDM2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型σ70基因rpoD的氨基酸序列SEQ ID NO:1相比，其特点为：(1)该σ70突变基因rpoDM2，携带三个突变位点，分别为：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln。(2)携带该σ70突变基因rpoDM2的大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8能够耐受2％(v/v)丁醇，而野生型大肠杆菌在0.1％(v/v)丁醇浓度下就停止生长。
【技术特征摘要】
1.采用随机突变全局转录因子σ70编码基因rpoD的方法，获得一种显著提高大肠杆菌丁醇耐受性的σ70突变基因rpoDM2，其特征在于：rpoDM2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型σ70基因rpoD的氨基酸序列SEQ ID NO:1相比，其特点为：(1)该σ70突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，司海明，韩瑞枝，许国超，董晋军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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