本发明专利技术公开了一种黄曲霉致病基因AfsumO及在筛选防治黄曲霉污染药物的应用。本发明专利技术还公开了一种筛选抑制黄曲霉致病性或筛选防治黄曲霉污染的药物的方法。更加具体地，该方法包含，在黄曲霉的培养体系中添加待筛选的候选物，并用针对AfSumO蛋白或蛋白片段的抗体检测黄曲霉体内的AfSumO蛋白的表达水平和SUMO化修饰水平，并与不添加候选物的对照组进行比较，如果测试组中AfSumO蛋白的表达水平和SUMO化修饰水平在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉的致病性的潜在药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一种黄曲霉致病基因AfsumO及在筛选防治黄曲霉污染药物的应用。
技术介绍
黄曲霉（Aspergillus flavus）是广泛分布于自然界的腐生真菌，生长和扩散能力极强。黄曲霉可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的危害最大，具有强肝脏毒性和致癌效应。目前全球每年有25%农作物被霉菌毒素污染，其中最为严重的就是黄曲霉毒素的污染。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重，结果导致黄曲霉毒素通过食物链危害人类健康。由于黄曲霉毒素的理化性质稳定，大规模工业加工、日常烹饪条件或者巴氏灭菌等都无法清除污染。因此黄曲霉污染危害巨大，研究预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。黄曲霉产孢、产毒的能力与其生长、扩散、繁殖和毒性密切相关，影响黄曲霉的致病性，一直以来科学家围绕黄曲霉致病性调控机理展开了大量研究。随着黄曲霉全基因组测序的完成，对其致病性相关的遗传因素筛查和研究日渐增多，然而目前发现即使完全相同遗传背景下，黄曲霉的产毒量也可能差异极大。这就提示黄曲霉对非遗传因素的影响非常敏感。这其中有关外界环境因子如营养、温度、水活度、pH值、氧化状态以及群体感性等影响黄曲霉形态和产毒的研究已开展多年，而关于体内非遗传因素调控黄曲霉致病性研究则仍处在起步阶段。研究发现真菌的次级代谢相关基因的转录和表达极有可能受到组蛋白乙酰化、DNA甲基化等表观遗传因素调控。黄曲霉毒素合成相关基因簇内的基因是按顺序激活的，而这种顺序则由组蛋白H4的乙酰化来介导，黄曲霉毒素的产量与组蛋白H4的乙酰化水平是正相关的。除了表观遗传因素，许多生命进程还由可逆翻译后修饰控制的，如磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化等。这些翻译后修饰也被认为可能是联接遗传背景、环境因子两大因素的重要桥梁之一，介导两者的复杂交互作用，最终影响生物的性状。在构巢曲霉中的研究发现蛋白激酶A（PKA）可能对AlfR进行磷酸化修饰，影响AlfR的核定位，进而抑制产孢和杂色曲霉素的合成，提示重要信号分子的磷酸化修饰可能也是AFB1生物合成的调控因素之一。敲除构巢曲霉的sumO基因后，菌株的孢子产量和次级代谢产物都明显降低了。黄曲霉中还未见关于SUMO化修饰的研究报道，SUMO化修饰对黄曲霉的致病性是否有影响也是未知的。本专利技术人经过广泛研究，首次在黄曲霉中分离出一种黄曲霉致病相关基因，本专利技术人将之命名为AfsumO基因。因此，本专利技术公开了一种黄曲霉致病基因AfsumO，该基因缺失的黄曲霉菌株致病力下降，本专利技术还公开了一种通过检测黄曲霉体内AfSumO蛋白的表达水平和SUMO化水平来筛选抑制黄曲霉致病性或筛选防治黄曲霉污染的药物的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄曲霉致病基因AfsumO及应用。本专利技术的另一目的在于提供一种筛选抑制黄曲霉致病性的潜在物质的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：通过生物信息学同源比对分析方法，在黄曲霉基因组中寻找AfsumO基因；构建黄曲霉AfsumO基因缺失株，确定AfsumO基因缺失是否影响黄曲霉致病性：检测黄曲霉致病性相关检测指标包括：(1) 相对于野生型黄曲霉，产生的孢子数量；(3) 相对于野生型黄曲霉，黄曲霉毒素的产量；(4) 相对于野生型黄曲霉，产毒相关基因的表达；(5) 所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflA基因，aflB基因，aflC基因、aflD基因、aflE基因、aflF基因、aflG基因、aflH基因、aflI基因、aflJ基因、aflK基因、aflL基因、aflM基因、aflN基因、aflO基因、aflP基因或aflQ基因。(6) 相对于野生型黄曲霉，侵染宿主的能力；(7) 所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；(8) 所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖生成菌丝、产生孢子、产生黄曲霉毒素AFB1或AFB2。⊿AfsumO菌株通过同源重组的方法从黄曲霉菌株（Zhuang, Z. et al. Toxins, 2016, Jan 20, 8(1), pii: E29.）的染色体中敲除AfsumO基因或基因片段获得，所述的AfsumO基因：(1) 具有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列；或(2) 截短的SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码AfSumO蛋白或编码降低活性（优选活性降低50%，更优选降低80%，更优选无活性）的AfsumO蛋白或蛋白片段。在本专利技术的第二方面，提供一种抑制黄曲霉的致病性的潜在药物的筛选方法，所述方法包括：(a) 在测试组中，在黄曲霉培养体系中添加待筛选的候选物，用相应抗体检测黄曲霉体内的AfSumO蛋白的表达水平和SUMO化修饰水平，并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、所述菌株的培养体系中，检测AfSumO的表达水平和SUMO化修饰水平；在一具体的实施方式中，所述用于分析检测AfSumO表达水平和SUMO化修饰水平的相应抗体包括：(1) 直接针对AfSumO蛋白或蛋白片段的抗体；或(2) 将AfSumO蛋白的N端与小分子多肽标签进行融合表达，针对小分子多肽标签的抗体；(b) 将步骤(a)测试组中AfSumO的表达水平和SUMO化修饰水平与对照组中AfSumO的表达水平和SUMO化修饰水平进行比较，如果测试组中AfSumO的表达水平和SUMO化修饰水平在统计学上低于（优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低）对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉的致病性的潜在物质。本专利技术的优点在于：只需要在蛋白水平上检测鉴定药物对黄曲霉毒性的抑制效果，而不需要提取黄曲霉毒素，减少各种有机挥发性化学试剂的使用，减少对环境的污染，同时也大大减少可能对实验操作人员产生的毒害。附图说明图1. 黄曲霉AfSumO蛋白与其同源蛋白的序列比对分析, Af_SumO表示黄曲霉的SumO蛋白，An_SumO表示构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中的SumO同源蛋白，Sc_Smt3代表酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的SumO同源蛋白，Ca_Smt3代表白念珠菌（Candida albicans）中的SumO同源蛋白，Sp_Pmt3（Schizosaccharomyces pombe）代表裂殖酵母中的SumO同源蛋白，Dm_Smt3代表果蝇（Drosophila melanogaster）中的SumO同源蛋白，Xl_SUMO1代表非洲爪蟾（Xenopus laevis）中的SumO同源蛋白，Hs_SUMO1代表人类（Homo sapiens）中的SumO同源蛋白。图2. 在黄曲霉中敲除AfsumO基因的策略及其染色体上的酶切图谱（图2A）、Southern杂交图谱（图2B）和半定量RT-PCR检测⊿AfsumO敲除株AfsumO基因的表达水平（图2C）。图中wild type表示野生型菌株，⊿Af本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄曲霉致病基因，其特征在于：所述基因为AfsumO基因：(1) 具有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列；或(2) 截短的SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码AfSumO蛋白或编码降低活性的AfSumO蛋白或蛋白片段。
【技术特征摘要】
1. 一种黄曲霉致病基因，其特征在于：所述基因为AfsumO基因：(1) 具有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列；或(2) 截短的SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码AfSumO蛋白或编码降低活性的AfSumO蛋白或蛋白片段。2. 如权利要求1所述的种黄曲霉致病基因在筛选抑制黄曲霉的致病性的潜在药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，筛选抑制黄曲霉的致病性的潜在药物的方法包括：(a) 在测试组中，在黄曲霉培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂鑫怡，汪世华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。