本发明专利技术公开了一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用，所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述的应用以含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化制备的纯酶为催化剂，以3,3,3‑三氟‑2‑羟基‑2‑甲基丙酰胺为底物，以pH为7～10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在60‑80℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)‑3,3,3‑三氟‑2‑羟基‑2‑甲基丙酸。本发明专利技术底物浓度为200g/L，酶活为753.5U/mg(Co2+存在条件下)，与已报道的酰胺酶相比，其底物浓度提高了2倍，酶活提高了近400倍。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种葡萄藤伯克氏菌，编码酰胺酶的酰胺酶基因、编码酶蛋白，含有该基因的重组载体以及转化得到的重组基因工程菌及其在催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺水解制备(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用。(二)
技术介绍
酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)可催化各类天然、非天然酰胺类化合物水解生成相应羧酸和氨。近年来，酰胺酶因其高立体选择性、广底物谱、高催化效率等优势，已成为制备手性羧酸和酰胺衍生物的重要生物催化剂，日益受到工业界的重视。目前，酰胺酶已成功用于多个手性药物中间体如(S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺(ZL200510061680)和(S)-哌嗪-2-甲酸(US5945534)等的工业化生产。3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methyl-propionic acid)，是一种重要的医药中间体，其S型或R型单体均可用于系列药物的手性合成。如S型单体可用于制备新型ATP敏感性钾(KATP)通道开放剂，治疗哮喘、尿失禁等；R型单体可用于合成一系列丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)抑制剂。PDK抑制剂通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶的活力可显著提高丙酮酸合成乙酰辅酶A效率，降低血液中葡萄糖含量，从而对肥胖、糖尿病及先天性乳酸血症起治疗作用。此外，(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸还可用于合成一系列缓激肽拮抗剂，用于治疗疼痛和炎症等。Konigsberger等采用枯草芽孢杆菌蛋白酶subtilisin水解外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸甲酯(乙酯)制备(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(Tetrahedron-Asymmetry,1999,10:679–687)，但产物光学纯度低，ee值仅为33％；Walter等利用Candida lipolytica酯酶催化外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸乙酯生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸乙酯(DE19725802A1)，但该路线同样存在产物光学纯度低的问题。瑞士Lonza公司Shaw等采用Klebsiella oxytoca来源重组酰胺酶动力学拆分外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(US7553652)，存在酰胺酶酶活、底物浓度及过程时空产率低等问题。因此，筛选立体选择性严格、酶活高、底物耐受强且稳定性好的生物催化剂对实现(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的工业化生产具有重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前酶法合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸存在酶活低、底物耐受差等缺陷，提供一种高活力、高立体选择性及高底物耐受的酰胺酶产生菌，表达所述酰胺酶的基因、含有该酰胺酶基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌，及其在催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(TFHMM)生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸((R)-TFHMA)中的应用。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶，所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述重组酰胺酶源自葡萄藤伯克氏菌(Burkholderia phytofirmans)ZJB-15079，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016260，保藏日期2016年5月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。任何对SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的，仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种所述重组酰胺酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。该酰胺酶基因从所述B.phytofirmans ZJB-15079中通过基因挖掘的方法获得，具体为：与筛选获得的B.phytofirmans ZJB-15079同源性较高的B.phytofirmans PsJN(GenBank登记号为No.CP001053)全基因组筛选模板，利用基因挖掘的手段有针对性地筛选一批假定的酰胺酶、乙酰胺酶序列，并设计引物。以所述B.phytofirmans ZJB-15079的基因组为模板，通过PCR技术将选定的酰胺酶序列进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。本专利技术的酰胺酶基因具体制备方法为：根据GenBank中收录的预测为酰胺酶、乙酰胺酶的基因序列设计合成引物，共筛选5段基因序列克隆，如表1所示。然后以B.phytofirmans ZJB-15079基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，最终获得一段具有R-选择性水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺活力的酰胺酶基因序列bp-ami，全长987bp。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。表1酰胺酶及酰胺酶引物序列如本领域技术人员所知，本专利技术的酰胺酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对SEQ ID NO.3所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种包含所述重组酰胺酶基因的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的酰胺酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本专利技术的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的酰胺酶基因产物bp-ami与载体pUC57连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶NcoI/HindⅢ双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET-28a连接，构建本专利技术的酰胺酶基因重组表达质粒pET28a-bp-ami。本专利技术涉及一种由重组酰胺酶编码基因构建的基因工程菌，可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的酰胺酶基因可以有效表达。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-bp-ami转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami。本专利技术所述重组酰胺酶的制备方法，包括如下步骤：培养本专利技术的重组表达转化体，诱导获得重组酰胺酶。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本专利技术的酰胺酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生酰胺酶即可。优选下述方法：将本专利技术涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶，其特征在于所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶，其特征在于所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。2.一种权利要求1所述来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。3.一种权利要求2所述来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶编码基因构建的重组载体。4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶在合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化制备的纯酶为催化剂，以3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺为底物，以pH为7～10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在60-80℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂为湿菌体时，湿菌体用量以缓冲液体积计为0.5～5g/L，所述催化剂为纯酶时，纯酶用量以缓冲液体积计为2～84mg/L，所述底物用量以缓冲液体积计为5～200g/L。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有Co2+或Ni2+作为促进剂，所述促进剂添加量以缓冲液体积计为1mM。9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酰胺酶编码基因的重组基...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，吴哲明，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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