一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3，所述基因的突变位点为R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了所述基因在制备木聚糖酶中的应用。实验证明，这种基因所编码的突变木聚糖酶活性可达到3897IU/mg，是野生型酶的107％；在外加盐浓度为4M时相对酶活性是野生型酶的1.92倍。预示该突变木聚糖酶具有耐高温、耐盐的特性，在饲料、食品、造纸、医药、能源等工业生产中具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3及其应用。
技术介绍
木聚糖是继纤维素后最丰富的植物细胞壁多糖，占地球上生物质资源总量的1/3。其主链骨架由木糖通过β-1,4糖苷键连接而成，而侧链包括多种官能团，如葡萄糖醛酸、阿魏酸、阿拉伯糖、乙酰基等。这种复杂的结构导致木聚糖的降解需要多种酶系共同作用。其中的关键酶是内切β-1,4-木聚糖酶，可以通过水解β-1,4-糖苷键来进行主链的降解，把木聚糖转变为木寡糖。在2008年，木寡糖已被中国卫生部批准为新功能性食品，它安全、高效、稳定，在食品、饲料、造纸、医药、能源等领域具有广阔的前景。来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的木聚糖酶XynA(TlXynA)是一种良好的工业用酶。它专一性地识别木聚糖底物；热稳定性强，最适温度在65℃以上，在80℃下孵育40min后仍保持60％的酶活(Damaso et al.,2003)；可以耐受广泛的pH；酶活性可高达4000IU/mg(Singh et al.,2003)。TlXynA可以用不同宿主进行异源表达，例如用毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达时，产量可以达到1.2g/L(Mellitzer et al.,2012)。因此，TlXynA是一种理想的工业用酶，可以用作烘焙剂、纸浆漂白剂、饲料添加剂、燃料乙醇生产时的底物处理剂等。但是，在TlXynA的实际应用中，仍存在着亟待解决的问题。例如工业生产中的很多步骤往往是在高盐浓度、存在胰蛋白酶的环境中进行的，这往往会限制TlXynA将最适条件下的高酶活性发挥出来。为了扩展TlXynA的工业应用，提高其耐高温、耐盐、耐胰蛋白酶酶解等性质是一个很关键的任务，然而，经检索，还未见关于TlXynA耐盐、耐胰蛋白酶酶解等性质和其相关突变基因的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3及其应用。本专利技术所述木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3，其特征在于：所述基因的突变位点为R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术所述木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3表达的木聚糖酶，其特征在于：所述酶命名为TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术所述木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3在制备木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T中的应用。含有木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3的重组载体pET28a-TlXynA-R116QR161QR187SK119T的构建及木聚糖酶
TlXynA-R116QR161QR187SK119T的表达及纯化。从NCBI数据库中获取木聚糖酶TlXynA基因，将TlXynA基因和质粒pET28a连接，获得pET28a-TlXynA质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；直接对质粒进行定点突变，引入R116Q、R161Q、R187S和K119T四个突变位点；将上述突变质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并测序鉴定阳性重组载体，提取质粒，即得到含有木聚糖酶突变基因TlXynA_3的重组载体pET28a-TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。将前述重组载体转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞，即获得含有重组载体的重组工程菌株。将获得的含有重组载体的重组工程菌株接种到LB液体培养基中，于37±2℃，200±10rpm条件发酵培养至OD600＝0.6-0.8；用终浓度为0.5mM的IPTG于20℃，200rpm条件培养20±2h，诱导表达得到木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T；离心并收集菌体，破碎菌体取上清，将上清液中的蛋白用镍柱进行纯化。本专利技术所述的木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T在制备耐高温耐盐工业酶制剂中的应用。实验证实：利用本专利技术所述的木聚糖酶突变基因TlXynA_3制备得到的木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T作为饲料添加剂、造纸漂白剂、烘焙剂等工业用酶时能在更广泛的环境中保持较高活性，具体应用包括但不仅限于：在饲料工业中，此突变木聚糖酶可以作为饲料添加剂，在动物消化系统中发挥作用，增加动物对饲料的消化和吸收；在造纸工业中，此突变木聚糖酶可以用来替代氯化物进行底物漂白处理，能够改善纸张白度和质量，减少环境污染；在食品工业中，此突变木聚糖酶可以作为酿酒时采用的添加剂，降低啤酒黏度，提高澄清度，还可以获得含有特定组成的寡糖，增加饼干的口感；在能源工业中，此突变木聚糖酶可以和纤维素酶共同作用降解被酸和离子溶液处理过的木质纤维素，更高效地产生乙醇等清洁能源。预示其具有广阔的应用前景。本专利技术具有的有益效果是：(1)本专利技术提供的将突变木聚糖酶异源表达和纯化的方法可以有效保持目的蛋白的高表达量，方法简便实用。(2)本专利技术中木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3所编码的突变木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T具有高酶活性，可达到3897IU/mg，是现有野生型木聚糖酶TlXynA活性的107％。(3)本专利技术中木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3所编码的突变木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T具有耐盐性，在外加盐浓度为1M到5M时，其相对酶活性分别是野生型木聚糖酶TlXynA的1.36、1.62、1.76、1.92和1.77倍。(3)本专利技术中木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3所编码的突变木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T具有耐高温、耐盐、耐胰蛋白酶酶解的特性，在造纸、饲
料、食品、医药、能源等工业领域均有广阔的应用。附图说明图1为本专利技术实施例3中TlXynA-R116QR161QR187SK119T蛋白表达的SDS-PAGE结果图，其中M为Unstained Protein Marker(Thermo Scientific,MA,USA)，1-7为突变木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T。图2为本专利技术实验例1中TlXynA-R116QR161QR187SK119T与TlXynA在不同盐浓度下的相对酶活性图，其中WT为TlXynA，M3为TlXynA-R116QR161QR187SK119T。图3为本专利技术实验例1中TlXynA-R116QR161QR187SK119T与TlXynA在外加盐浓度为0时的酶活性比较图，其中WT为TlXynA，M3为TlXynA-R116QR161QR187SK119T。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术保护内容做进一步的阐述，但所述实例并不是对本专利技术保护内容的限制。实施例1：构建含有木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3的重组载体，具体步骤如下：(1)从NCBI数据库中获取木聚糖酶T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3，其特征在于：所述基因的突变位点为R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3，其特征在于：所述基因的突变位点为R116Q、R161Q、R187S和K119T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3表达的木聚糖酶，其特征在于：所述酶命名为TlXynA-R116QR161QR187SK119T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述木聚糖酶TlXynA的突变基因TlXynA_3在制备木聚糖酶TlXynA-R116QR161QR187SK119T中的应用。4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王禄山，刘诗佳，吴秀芸，张怀强，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37