本发明专利技术公开了一种具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和应用。本发明专利技术还公开了一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，为(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；或(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。本发明专利技术的基因工程酵母，基因组中整合有该核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列，为具有高效糖化功能的酿酒酵母，在不额外添加糖化酶进行酒精发酵时，可获得高产量的乙醇。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和应用。
技术介绍
乙醇是食品、化工等工业的重要原料和可再生燃料。纤维素乙醇生产技术目前尚处在开发中，未能满足商业化的要求。市场上在售的乙醇主要是以玉米和甘蔗为原料进行生产的，原料分别富含淀粉和糖分。在我国，除了玉米，小麦和木薯等富含淀粉的原料也被用于生产乙醇。改进现有技术，降低淀粉质原料转变为乙醇的加工成本非常重要。目前，淀粉质原料生产乙醇需要经过多个环节，如：粉碎、液化、糖化、发酵、蒸馏等。其中，糖化的过程需要添加糖化酶(即葡萄糖淀粉酶，EC 3.2.1.3)，把淀粉降解为葡萄糖。该酶可以从市场上直接购买。生产每吨乙醇需要的糖化酶成本约100元。如果发酵菌种具备葡萄糖淀粉酶功能，那么糖化酶的用量可以减少。鉴于此，为了降低乙醇的生产成本，有必要开发具有糖化功能的酿酒酵母。从80年代中期开始，各种来源的葡萄糖淀粉酶被克隆到酿酒酵母中，构建具备糖化功能的酵母菌株。1985年Cetus公司在Science上发表论文，报道了利用基因工程技术把来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡萄糖淀粉酶克隆到酿酒酵母中的工作，重组菌株能够以淀粉为唯一碳源进行生长(Science,1985.228(4695):p.21-6)。除泡盛曲霉来源外，米根霉(Rhizopus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡萄糖淀粉酶也常被使用。为了增加糖化淀粉的能力，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)随后也被克隆到酿酒酵母中，与葡萄糖淀粉酶协同糖化淀粉。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、德巴利酵母(Debaryomyces occidentalis)和大麦(Hordeum vulgare)等是α-淀粉酶的常用来源。有报道揭示，牛链球菌而非嗜热脂肪芽孢杆菌来源的α-淀粉酶与米根霉葡萄糖淀粉酶的共表达能使重组菌以生淀粉为原料进 行糖化和发酵。这是因为嗜热脂肪芽孢杆菌来源的α-淀粉酶不具有淀粉结合结构域，其与米根霉葡萄糖淀粉酶的共表达只能使重组菌以可溶性淀粉为原料进行糖化和发酵。此外，脱支酶(E.C.3.2.1.33普鲁兰酶和异淀粉酶)和麦芽糖转运蛋白也被克隆到酿酒酵母中用于增强淀粉的糖化和发酵。近期，主要有两个课题组继续从事这方面的工作，日本Akihiko Kondo教授领导的团队致力于利用表面展示技术构建糖化酵母(Enzyme Microb Technol,2012.50(6-7):p.343-7.)，而韩国Suk Bai教授领导的团队则致力于利用分泌表达技术构建糖化酵母(Biotechnol Lett,2011.33(8):p.1643-8.)。上述研究多是以基础研究为导向，难以满足工业化应用的要求。例如：使用的宿主为实验室菌株，带有营养缺陷表型，这使得重组菌不够强壮，生长速率和发酵性能低下等问题；多基于2μm质粒表达载体，该质粒的好处是多拷贝，缺点是在非选择压力条件下，很容易丢失。因此，本领域尚需研发可以满足工业化应用要求的具有高效的糖化功能的酿酒酵母。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高效的糖化功能的酿酒酵母。本专利技术的第一方面，提供一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下组：(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。本专利技术的第二方面，提供一种表达载体，包含第一方面所述的核苷酸序列。本专利技术的第三方面，提供一种酵母宿主细胞，所述的酵母宿主细胞含有第二方面所述的表达载体或者基因组中整合有第一方面所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列。在另一优选例中，所述酵母宿主细胞内不含抗生素抗性基因。在另一优选例中，所述酵母宿主细胞为酿酒酵母，保藏编号为CCTCC M2014657。本专利技术的第四方面，提供一种生产葡萄糖淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适合表达条件下，培养如第三方面所述的酵母宿主细胞，从而表达葡萄糖淀粉酶；(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的葡萄糖淀粉酶。本专利技术的第五方面，提供一种酵母宿主细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(a)制备三个片段，所述三个片段分别为ENO1p-GA-ENO1t、delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEF1p-KanMX-TEF1t-loxP、ADH1p-GA-PDC1t；(b)将步骤a)获得的三个片段连接，得到目的质粒pYIE2-2GA-delta；(c)将步骤b)获得的pYIE2-2GA-delta经NotI线性化后，转化酿酒酵母得到转化子；(d)消除步骤c)获得转化子培养的菌株中的抗性基因，得到所述重组酵母。本专利技术的第六方面，提供第三方面所述的酵母宿主细胞的用途，用于发酵产乙醇。本专利技术的第七方面，提供一种生产乙醇的方法，所述方法采用第三方面所述的酵母宿主细胞进行发酵从而生产乙醇。本专利技术以酿酒酵母CCTCC M94055为宿主，采用多拷贝整合技术，把糖化酶即葡萄糖淀粉酶整合到基因组上，随后消除抗生素抗性基因，获得的重组酿酒酵母，具有高效的糖化功能。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为pYIE2-2GA-delta质粒图。具体实施方式本申请的专利技术人经过广泛而深入地研究，以酿酒酵母酵母CCTCC M94055为宿主，采用多拷贝整合技术，把糖化酶即葡萄糖淀粉酶整合到基因组上，随后消除抗生素抗性基因。意外发现，获得了具有高效的糖化功能的酿酒酵母，在不额外添加糖化酶进行酒精发酵时，可获得高产量的乙醇。在此基础上，完成了本专利技术。本专利技术获得的具有高效的糖化功能的酿酒酵母1522(Saccharomyces cerevisiae 1522)，于2014年12月23日保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014657。表达载体本专利技术的表达载体，包含编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下组：(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。在另一优选例中，所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥85％相同性，较佳地，具有≥90％相同性，更佳地，具有≥95％相同性，更佳地，具有≥98％相同性，甚至具有≥99％相同性。在另一优选例中，，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。在另一优选例中，所述表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列选自下组：(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。
【技术特征摘要】
1.一种编码葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列选自下组：(a)所述的核苷酸序列的编码SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列与SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列。4.一种酵母宿主细胞，其特征在于，所述的酵母宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求1所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶编码区的序列。5.如权利要求4所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母宿主细胞内不含抗生素抗性基因。6.如权利要求4所述的酵母宿主细胞，其特征在于，所述酵母宿主细胞为酿酒酵母，保藏编号为CCTCC M 2014657。7.一种生产葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，
申请(专利权)人：安琪酵母股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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