本发明专利技术提供了一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，还提供了利用该方法获得的一株具有副产物低、高酒精耐性的优良工业酿酒酵母工程菌株及其应用；运用本发明专利技术方法可改良酿酒酵母菌株的糖醇转化率、耐性、发酵速率等多种生产性能，改良菌株可用于工业浓醪酒精发酵生产，减少能耗，降低生产成本；此方法也可用于其它工业微生物性能的改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法。
技术介绍
酒精浓醪发酵，简单来说就是发酵过程中的高浓度发酵，具体表现在生产有以下特点:1、高酒份；2、高渗透压；3、高酵母数。就酒精生产而言，不同原料、不同时期浓醪发酵的界限存在着明显的差别；大概区分如下:淀粉质原料:酒精浓度在14 16% (V/V)，糖蜜原料:酒精浓度在10 12% (V/V)0实现酒精浓醪发酵技术，可极大地提高设备利用率、减少工艺用水、降低蒸煮蒸馏能耗和生产成本，对提高乙醇生产的效率与经济和社会效益具有重要现实意义和应用价值。与常规酒精发酵相比，酿酒酵母在浓醪发酵过程中，不仅面临着更加严峻的环境胁迫(高渗、高酒精胁迫等)，还会因甘油、乙酸等副产物生成的增多而降低葡萄糖乙醇转化率。因此,为达到工业化生产对发酵速率、乙醇产量和糖醇转化率等技术指标的要求,选育副产物合成低并具有高耐性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵技术瓶颈的关键所在。甘油是酿酒酵母发酵生产乙醇过程中主要的副产物，约消耗4% 10%的总碳源，如这些碳源用于生成乙醇，全球每年无需增加成本即可增产乙醇13亿升。目前，对酵母细胞甘油代谢途径已研究比较透彻，应用基因代谢工程技术对甘油合成相关的基因及途径进行修饰和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在发酵过程中对高糖、高浓度乙醇等胁迫因子耐受性下降，生长缓慢，进而引起发酵速率降低、发酵周期延长及乙醇产量降低等不良现象。针对一个或少量基因调控、机制已知的性状，基因代谢工程方法是较容易和直接的可行性理性策略，但对于涉及多个基因及其调控网络的复杂性状(如发酵速率、耐受性等发酵性状)，基因代谢工程技术很难达到预期效果，甚至会引起菌株关键性能的退化衰变。目前，已有研究应用基于全基因组水平的盲目育种技术一全基因组重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高浓度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生产性能如糖醇转化率提高并不显著，而且随着醪液可发酵性碳源的增加，副产物合成也增加，极大限制了乙醇产量的提高。综上所述，应用单一的育种手段虽然能够改良菌株某一方面的性状，但很难获得性能全面的优良菌株，而且容易导致生产菌株关键性能的退化衰变。要从根本上突破浓醪发酵技术瓶颈，获得性能全面的 优良酿酒酵母菌株，还是需要结合不同的工业微生物育种策略优势，实现优劣互补，集成创新，更有效、快速地进行工业生产菌株的改良。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种集成基因代谢工程与全基因组重排技术改良菌株多种生产性能的方法。本专利技术采用的技术方案是:一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括:(1)诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Yl和交配型α的单倍体菌株Υ2作为出发菌株；(2)然后分别敲除菌株Yl和菌株Υ2的编码甘油转运蛋白的基因FPSl，并在FPSl位点整合表达变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN),对单倍体Yl和Y2分别采用GMSlr和Zeolr抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株:6418^抗性菌株 YFGl (MATa, fpsl Δ::PGKp_gapN)和 Zeor 抗性菌株 YFG2 (MAT a，fpsl Δ::PGKp-gapN)；(3)分别使用紫外和EMS对菌株YFGl和菌株YFG2进行诱变，获得四个突变库:YFGl紫外诱变库、YFG1EMS诱变库、YFG2紫外诱变库和YFG2EMS诱变库；(4)以体积浓度8%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第一轮全基因组重排，用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，诱导重排子产孢破壁后，用体积浓度12%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第二轮全基因组重排，用含300 μ g/mLG418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，通过模拟工业原料的浓醪发酵测试,获得低副产物合成、高糖醇转化率和高乙醇产量的工业酿酒酵母工程菌株。所述甘油转运蛋白的氨基酸序列GenBank号NP_013057 ;所述变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN)的氨基酸序列的GenBank号为AAA91091o所述甘油转运蛋白的编码基因GenBank号NM_001181863 ;所述变链球菌(Streptococcus mutans)的3-憐酸甘油醒脱氧酶(GAPN)的编码基因GenBank号为L38521。由上述方法获得的一株低甘油合成、高酒精耐性的工业酿酒酵母菌株一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FGl,提议的分类命名为:Saccharomyces cerevisiae FGl(MATa/a fpsl Δ::PGKl_gapN fpsl Δ::PGKl_gapN)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号=CCTCC No:M2011274，保藏日期:2011年8月1曰。所述酿酒酵母CCTCC No:M 2011274可用于微生物工业浓醪发酵生产酒精。具体为:将酿酒酵母CCTCC No:M 2011274接种至以双酶法配制的玉米糖化醪发酵液，30 35°C发酵60 80h，发酵结束后发酵液经分离纯化获得酒精。具体的，所述玉米糖化醪发酵液可按常规双酶法配制，本专利技术中具体如下:取玉米粉，加2 3倍质量的水调浆，搅拌加热至50 70°C，加入耐高温α -淀粉酶IOU 30U/g玉米粉，混匀后加热至80 90°C进行糊化液化，100 110°C保温0.5 2h ;糊化醪冷却至50 70°C，加入糖化酶100U 300U/g玉米粉，55 60°C糖化0.5 1.0h,即得所述玉米糖化醪发酵液。本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术提供了一株具有副产物低、高酒精耐性的优良工业酿酒酵母工程菌株及其应用，以及一种改良工业菌株多种生产性能的方法——基因代谢工程与全基因组重排联用；运用此方法可改良酿酒酵母菌株的糖醇转化率、耐性、发酵速率等多种生产性能，改良菌株可用于工业浓醪酒精发酵生产，减少能耗，降低生产成本；此方法也可用于其它工业微生物性能的改良。附图说明图1为G4181抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意图；图2为Zeolr抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意图；图3为全基因组重排流程图;其中Q为G418r抗性的基因工程菌株YFGI, 为Zeor抗性的基因工程菌株YFG2 ；图4为乙醇胁迫条件下菌株的生长曲线；(■，□)对照菌株Y12;(.，〇)基因工程菌株YFG12 ; ( ▲，Δ )基因工程重排子FGl ;图中空心图标为0% (ν/ν)乙醇胁迫条件；实心图标为10% (ν/ν)乙醇胁迫条件；图5为浓醪发酵性 能测试；㈩出发菌株Ζ87 ; ( □)对照菌株Υ12 ;(〇)基因工程菌株YFG12 ;(▲)基因工程重排子FG1。Α:残糖；B:乙醇。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1:工业酿酒酵母甘油代谢工程菌株的获得1、单倍体出发菌株的获得将工业酿酒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括：（1）诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Y1和交配型α的 单倍体菌株Y2作为出发菌株；（2）然后分别敲除菌株Y1和菌株Y2的编码甘油转运蛋白的基因FPS1，并在FPS1位点整合表达变链球菌（Streptococcus mutans）的3‑磷酸甘油醛脱氢酶（GAPN），对单倍体Y1和Y2分别采用G418r和Zeor抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株：G418r抗性菌株YFG1和Zeor抗性菌株YFG2；（3）分别使用紫外和EMS对菌株YFG1和菌株YFG2进行诱变，获得四个突变库：YFG1紫外诱变库、YFG1 EMS诱变库、YFG2 紫外诱变库和YFG2 EMS诱变库；（4）以体积浓度8%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第一轮全基因组重排，用含300μg/mL G418 和50μg/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，诱导重排子产孢破壁后，用体积浓度12% 的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第二轮全基因组重排，用含300μg/mL G418 和50μg/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，通过模拟工业原料的浓醪发酵测试，获得低副产物合成、高糖醇转化率和高乙醇产量的工业酿酒酵母工程菌株。...
【技术特征摘要】
1.一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括: (1)诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Yl和交配型α的单倍体菌株Υ2作为出发菌株； (2)然后分别敲除菌株Yl和菌株Υ2的编码甘油转运蛋白的基因FPSl，并在FPSl位点整合表达变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN),对单倍体I和Y2分别采用GMSlr和Zeolr抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株:6418^抗性菌株YFGl和Zeolr抗性菌株YFG2 ； (3)分别使用紫外和EMS对菌株YFG...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪昌，王品美，郑道琼，陶香林，刘天喆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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