在多形汉逊酵母中克隆和表达了来自酵母西方许旺酵母的分别编码α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因SWA2和GAMl。通过将SWA2基因和GAMl基因与多形汉逊酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(HpGAP)的强组成型启动子可操作地连接后整合入多形汉逊酵母的染色体中而实现该表达。所得转化体获得在包含可溶性淀粉作为唯一碳源的基本培养基上生长的能力，并可在高温发酵下由淀粉生产乙醇，高达10g/L。编码木聚糖内切酶的XYN2基因是从真菌里氏木霉获得，并且编码β-木糖苷酶的xlnD基因是从真菌黑曲霉获得。在HpGAP启动子的控制下通过将这些基因整合入多形汉逊酵母染色体中还实现这些基因的共表达。所得转化体能够在补充桦木木聚糖作为唯一碳源的基本培养基上生长。木聚糖降解酶的成功表达得到能够在48℃将桦木木聚糖发酵为乙醇的受体菌株。另外上述基因在过表达丙酮酸脱羧酶基因的多形汉逊酵母菌株中的共表达进一步提高乙醇生产量。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及通过发酵进行纤维素乙醇生产的领域，具体地涉及淀粉和木聚糖碳源的发酵，更具体地涉及用于通过淀粉和木聚糖发酵进行乙醇生产的重组多形汉逊酵母(H. poIymorpha)菌株,并且还更具体地涉及分泌重组的α淀粉酶和葡糖淀粉酶、和/或木糖水解酶和木糖苷酶以通过在含淀粉和木聚糖的培养基上进行发酵实现乙醇生产的多形汉逊酵母菌株。 前言由可再生原料如植物生物质进行燃料乙醇生产具有重要的经济学和生态学意义。植物木质纤维素具有作为目前生物乙醇生产中被广泛应用的蔗糖和基于淀粉的多糖的替代性原料的潜力。木质纤维素和其他植物来源的多糖代表了一种可通过二氧化碳的生物转化进行再生产的可再生的持续性能量来源。由植物生产的生物燃料胜过化石燃料的许多受追捧的环境益处之一是温室气体的显著减少[6，24]。目前世界上生产的绝大多数的乙醇来源于淀粉或蔗糖。许多农作物中富含淀粉和糖类，但是当乙醇作为一种液体交通运输燃料而扩大生产时，需要不与食物和动物饲料的使用直接竞争的原料。这些原料包括来自农业和林业上的木质纤维素副产品残余物[14]。木质纤维素是来源于木材和农业残余物的植物物质的通用术语。其主要包含木质素和纤维素以及大量的半纤维素，具有较少量的结构蛋白和有机溶剂可萃取的物质[14]。半纤维素是由作为骨架的木聚糖组成并且存在于植物细胞壁中的一种取代的多糖[11]。木质纤维素和淀粉加工成乙醇包括四个主要的单元操作预处理，水解，发酵和产物分离/纯化。淀粉的生物转化包括酶水解和所得的葡萄糖发酵成乙醇，伴随动物饲料副产品的产生。由于木质纤维素具有较复杂的结构，并且在不同植物(谷类植物、软木材、硬木材等)和同一植物(茎、壳、杆、穗轴、稻杆、叶、核等)中的组成具有很大不同，因此木质纤维素的水解较为困难[14]。木糖是在具有C5 L-阿拉伯糖和其他C6糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖作为主要己糖的半纤维素成分水解得到的主要的戊糖[11]。由于木质纤维素的工艺涉及许多步骤，且需要高能量投入，因此，木质纤维素作为原料的商业生机需要开发更直接且廉价的技术。糖类聚合物的直接微生物转化(DMF，直接微生物发酵)是一种可使由木质纤维素生产生物乙醇的经济效益提高的选择。开发这项技术的关键先决条件之一是获得能够在高温下直接使淀粉和木聚糖发酵成乙醇的微生物。目前DMF所涉及的水解酶的最佳温度约为50°C，而目前由木质纤维素糖类和淀粉糖类进行生物乙醇生产所用的绝大部分微生物为嗜温生物，其最佳生长和发酵温度在28°C到40°C之间[6]。本实验室的最近研究显示耐热的甲基营养型酵母多形汉逊酵母能够在高温(37-480C )下使D-木糖和D-葡萄糖发酵为乙醇。因为多形汉逊酵母生长和发酵的最佳温度较高，所以它是用于DMF技术的深入开发的一个优秀候选者[3，26]。由于多形汉逊酵母不能利用淀粉和木聚糖作为碳源和能量来源，所以异源木聚糖降解酶基因和淀粉降解酶基因在这种酵母中的克隆和过表达是必需的。β -1，4木聚糖是存在于植物细胞壁的几乎所有部分中的异质性多糖。β -1, 4-连接的木糖单体形成主链，主链上连接有一些取代基[30]。木聚糖主链的水解由β_1，4木聚糖内切酶(1，4-β-D-木聚糖的木聚糖水解酶，EC3. 2. 1.8)和β-D-木糖苷酶(1，4-β- 木聚糖的木糖水解酶，EC 3.2.1.37)催化。β-木聚糖内切酶作用于木聚糖和木寡糖，主要产生木寡糖的混合物。β-D-木糖苷酶将木寡糖水解为D-木糖[19]。真菌木霉属(Trichoderma)和曲霉属 (Aspergillus)分泌大量有效的木聚糖降解酶。里氏木霉(Trichoderma reesei)是已知具有纤维素水解活性和木聚糖水解活性的一种丝状嗜温性真菌[3]。由这种真菌分泌的两种主要可诱导型木聚糖内切酶为Xynl和Xyn2。Xyn2占木聚糖上培养的里氏木霉的总木聚糖水解活性的50%以上。曲霉属的成员也是纤维素水解酶和木聚糖水解酶的有效生产者。编码804个氨基酸的β-木糖苷酶的黑曲霉(A. niger)的xlnD基因在酵母中被成功表达[19]。淀粉由两种高分子量成分组成直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉为较少的组分(20-30%)，是由α -1，4-连接的葡萄糖残基和一些α -1, 6支化点形成的一种直链多糖；而支链淀粉代表淀粉中的较多的成分(70-80%)，且高度分支[4]。淀粉由两种分泌的淀粉酶降解α -淀粉酶和葡糖淀粉酶[25]。α -淀粉酶(1，4_ a -D-葡聚糖的葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)催化淀粉和相似底物的α-1,4-葡萄糖苷键的淀粉内部裂解，释放麦芽糖、寡糖和极限糊精。葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC 3.2. 1.3)水解葡萄寡糖(glucooligosaccharide)和麦芽糖为D-葡萄糖。酵母西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)生产分解淀粉的酶类,并使淀粉高效地发酵成乙醇[34]。由这种酵母分泌的α -淀粉酶是由SWA2基因编码。GAMl基因编码分泌性葡糖淀粉酶。一些从谷物颗粒如玉米的加工中得到的农业木质纤维素残余物(如玉米纤维壳)含有大量的淀粉。因此建立能够将淀粉和木质纤维素直接积极转化成乙醇的微生物菌株具有重大的经济意义。概述本文描述的是能够直接使淀粉和木聚糖进行乙醇发酵的分解淀粉和木聚糖的多形汉逊酵母菌株。我们在此描述了通过将基因西方许旺酵母SWA2和GAM1，里氏木霉ΧΥΝ2和黑曲霉xlnD成功插入该酵母的染色体中并表达它们而构建菌株。同时，过表达丙酮酸脱羧酶(roc)的菌株经过基因工程改造而具有这些基因中的一个或多个。在每种情况中菌株都能够单独在含可溶性淀粉或可溶性木聚糖的培养基上生长，并且能够以不同水平使可溶性淀粉或可溶性木聚糖发酵为乙醇。同时过表达roc的菌株给出比仅过表达SWA2和GAMl基因的菌株更高的乙醇滴度。本专利技术提供一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码α -淀粉酶的至少一种基因和编码葡糖淀粉酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性淀粉作为碳源的培养基中生长。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α -淀粉酶和葡糖淀粉酶中至少其一的基因可以被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α -淀粉酶和葡糖淀粉酶的所述基因中的每一种均可以被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码所述α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的所述基因中的至少一种可以是从西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)菌株获得。在所述多形汉逊酵母菌株中，编码α -淀粉酶或所述葡糖淀粉酶的所述至少一种基因还可以包括与所述基因可操作地连接以终止所表达的基因的转录的终止子。在所述多形汉逊酵母菌株中，所述启动子可以包括从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子。在所述多形汉逊酵母菌株中 ，所述α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶的基因中的每一种都可以与从多形汉逊酵母获得的HpGAP启动子可操作地连接。所述多形汉逊酵母菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码木聚糖内切酶的至少一种基因和编码β?木糖苷酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性木聚糖作为碳源的培养基中生长。
【技术特征摘要】
2008.05.06 US 61/050,6851.一种多形汉逊酵母菌株，所述多形汉逊酵母菌株包含编码木聚糖内切酶的至少一种基因和编码β -木糖苷酶的至少一种基因，所述基因与在所述多形汉逊酵母菌株中表达所述基因的至少一种启动子可操作地连接，并且所述酶以充足的量自所述多形汉逊酵母菌株输出到培养基中，从而允许所述多形汉逊酵母菌株在只含可溶性木聚糖作为碳源的培养基中生长。2.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶中至少其一的基因被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。3.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶和木糖苷酶的所述基因中的每一种均被整合入所述多形汉逊酵母的染色体中。4.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中编码所述木聚糖内切酶或木糖苷酶的所述基因中的至少一种是从选自由黑曲霉(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reseei)所组成的组的菌株获得。5.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，编码所述木聚糖内切酶或所述木糖苷酶的所述至少一种基因还包括与所述基因可操作地连接以终止所表达的基因的转录的终止子。6.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母菌株，其中所述启动子包括从多形汉逊酵母获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·阿巴斯，安德烈·希博尼，安德烈·Y·沃罗诺夫斯基，
申请(专利权)人：阿彻丹尼尔斯米德兰德公司，
类型：发明
国别省市：
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