本发明专利技术提供了一种利用重组热带假丝酵母全细胞法生产木糖醇的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术所提供的用于木糖醇生产的基因工程菌是一种重组了外源木聚糖酶和木糖苷酶编码基因的热带假丝酵母菌，可用于全细胞法生产木糖醇。本发明专利技术所保护的重组热带假丝酵母菌株在保持原有木糖醇转化特性的基础上，通过导入外源木聚糖酶和木糖苷酶编码基因，在原始菌株中重构了木聚糖降解途径，实现了木聚糖降解和木糖醇生产的耦合，获得了以天然半纤维素原料为底物直接进行木糖醇全细胞法发酵生产的特性。本发明专利技术提供的利用重组热带假丝酵母全细胞法生产木糖醇的工艺简单、成本低、条件温和、能耗少、排污少，为木糖醇的生产开创了一条高效清洁无污染的工业化应用技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组热带假丝酵母工程菌的构建及其在全细胞法生产木糖醇中的应用。
技术介绍
木糖醇(英文名xylitol,化学名称1，2，3，4，5_pentahydroxypetane),又称戍五醇。木糖醇作为木糖代谢的中间产物之一，是一种天然存在的五碳糖醇。木糖醇是一种高甜度低热量的天然植物甜味剂，是一种高附加值的多元醇。木糖醇具有非致龋性，其在体内代谢不依赖胰岛素，并具有保肝护肝的作用，被广泛应用于口腔卫生、医药产品、食品添加剂等工业领域中。 目前已商品化的木糖醇生产都是采用化学转化法。先将来源于不同生物质原料的半纤维素经酸或碱水解处理，使其中的多缩戊糖水解为D-木糖，然后经过复杂的脱毒、脱色等工序去除有害杂质，再在镍催化剂作用下将水解液中的木糖进行加氢还原获得木糖醇。化学法生产木糖醇产量低，在生产过程中需要高温高压，最后的催化液中成分复杂，木糖醇的提取纯化比较困难。整个木糖醇生产工艺复杂，能耗高、污水排放量高，生产成本高，严重限制了木糖醇的生产和应用。微生物转化生产木糖醇条件温和，而且具有专一性好、转化效率高、成本较低等优点，是替代化学法生产的理想途径。一般来说，酵母被认为是最好的木糖醇转化微生物。目前用于生产木糖醇的酵母菌株包括能够代谢木糖的天然酵母菌，以及利用树干毕赤氏酵母(Pichiastipitis)的木糖还原酶基因(XYLl)构建的重组酿酒酵母菌。这些酵母菌株转化生产木糖醇时，其底物木糖仍要通过硫酸或碱水解半纤维素原料获得，工艺过程仍需排放大量废水，受到国家环保指标的严格限制。同时，硫酸或碱水解半纤维素原料获得的水解液中，往往含有苯酚、糠醛等毒性物质及其他抗营养因子，对酵母细胞的生长具有极大的毒害作用，进而影响菌株发酵生产木糖醇的能力。因此，直接以半纤维素原料为底物，采用全细胞法清洁生产木糖醇成为未来木糖醇工业发展的必然趋势，能够解决半生物合成法的高能耗、高排污的行业问题，以实现过程的节能减排，推动生物质资源利用整体技术进步。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用重组热带假丝酵母全细胞法生产木糖醇的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是提供一种重组热带假丝酵母工程菌株，分别克隆木聚糖酶(XYN)和木糖苷酶(XYL)编码基因，利用分子生物学技术将这两条基因片段的完整表达盒导入酵母表达载体PAUR123中，构建重组质粒pAUR123-Xyn-Xyl后转入木糖利用型热带假丝酵母(Candida tropicalis)中得到工程菌株。本专利技术的重组热带假丝酵母菌株C. tropicalis PNL能共表达木聚糖酶和木糖苷酶,这两种酶均为胞外分泌型,活性高。该重组菌能直接利用玉米芯半纤维素为底物，实现全细胞法生产木糖醇，减少了环境污染。所述重组的热带假丝酵母菌株C. tropicalis PNL在全细胞法生产木糖醇中的应用。(I)菌体种子液的制备在摇瓶中按10-50%的装液量加入种子培养基，所用种子培养基配方为木糖(5_50gL)、蛋白胨(I-IOgL)、酵母膏(l-10g/L)、K2HPO4(l_5g/L)、MgSO4 · 7H20 (O. 1-0. 5g/L)、CaCl2 (0. 1-0. 5g/L)，pH4. 5-6. 5，在 100-130°C下灭菌 10_30min后，在无菌条件下从活化平板上挑取C. tropicalis PNL单菌落接入上述摇瓶中，培养温度为30-40°C，摇床转速为150-300rpm，培养时间为12_30h，得到菌体种子液备用。优选的，种子培养基木糖含量为5_25gL,蛋白胨含量为3_8gL,酵母膏含量为2-6gL, K2HPO4 含量为 l-3g/L, MgSO4 · 7H20 含量为 O. 1-0. 3g/L, CaCl2 含量为 O. 1-0. 3g/L,pH4. 5-5. 5。优选的，种子培养基装液量为15-35%。优选的，培养温度为32_38°C。优选的，摇床转速为160_200rpm。(2)木糖醇的全细胞法发酵生产在无菌条件下将上述步骤(I)制备好的菌体种子液，按1-15%的接种量接入盛有发酵培养基的摇瓶，装液量为20-80%。所用发酵培养基配方为葡萄糖5-40g/L、蛋白胨5-40g/L、酵母膏5_30gL、玉米芯粉10_50g/L，pH4. 5-6. 5。控制发酵温度为30-40°C，摇床转速为150-300rpm，发酵时间为24_120h。优选的，发酵培养基葡萄糖含量为10_25g/L,蛋白胨含量为l_25g/L,酵母膏含量为 5-15g/L，玉米芯粉含量为 10-30g/L，pH4. 5-5. 5。优选的，发酵培养基装液量为30-60%。优选的，接种量为3-10%。优选的，培养温度为32_38°C。优选的，摇床转速为160_200rpm。优选的，发酵时间为60_100h。本专利技术采用代谢工程的思想，通过基因工程手段获得重组的热带假丝酵母工程菌株-C. tropicalis PNL,其出发菌株C. tropicalis CICC1779能高效地转化木糖生产木糖醇。重组菌在保持原有木糖醇转化特性的基础上，通过导入外源木聚糖酶和木糖苷酶编码基因，在原始菌株中重构了木聚糖降解途径，实现了木聚糖降解和木糖醇生产的耦合，获得了以天然半纤维素原料为底物直接进行木糖醇全细胞法发酵生产的特性。本专利技术中重组热带假丝酵母菌株的优点在于木聚糖酶基因和木糖苷酶基因均置于酵母组成型强表达启动子PADHl的控制之下，不需要添加诱导剂，不必更换碳源，发酵工艺简单，条件温和；重组酶能表达分泌至发酵液中，活性高，木糖醇转化率较高；重组菌株能以玉米芯等天然半纤维素原料为底物，全细胞发酵生产木糖醇，整个工艺过程成本低、能耗少、排污少，具有产业化应用前景。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术所保护的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例I :重组热带假丝酵母工程菌株的构建(I)从土曲霉中克隆出木聚糖酶基因(atn)片段，与Genbank上已经公布的木聚糖酶基因序列作BLAST比对，进行同源性分析，结果显示，克隆的atn基因为一新基因(Genbank注册序列号为JQ087496)。(2)从土曲霉中克隆出木糖苷酶基因(atl)片段,与Genbank上已经公布的木糖苷酶基因序列作BLAST比对分析，结果表明，克隆的atl基因序列与Genebank中已报道的A. terreus NIH2624中β -木糖昔酶序列完全一致。(3)利用基因工程手段将木聚糖酶基因(atn)和木糖苷酶基因(atl)串联在一起，导入pAUR123载体中，构建pAUR-atn-atl质粒,将该质粒导入热带假丝酵母中，构建新的菌株，使木聚糖酶和木糖苷酶共表达，具体过程如下将atn基因连接到酵母真核表达载体pAUR123的多克隆位点上，获得重组质粒pAUR-atn ；根据PADHl和TADHl两端的碱基序列设计引物，并在引物两端添加Dra III酶切位点，以pAUR-atn质粒为模板，通过PCR方法扩增atn基因的表达盒P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组热带假丝酵母工程菌株C.tropicalis?PNL，其特征在于，将木聚糖酶和木糖苷酶基因表达盒串联在一起，导入酵母表达载体pAUR123中，构建重组质粒pAUR123?xyn?xyl，将该质粒导入木糖利用型热带假丝酵母中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春，郭晓晓，戴大章，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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