纤维素降解酶及其基因制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维素降解酶及其基因序列，所述的纤维素降解酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明专利技术的酶对多种微晶纤维素及滤纸具有较高的降解活性，可用于研究纤维素降解机理，以及作为潜在的纤维素生物转化的辅助因子。

【技术实现步骤摘要】
纤维素降解酶及其基因
:本专利技术涉及纤维素降解酶及其基因，属于生物
。
技术介绍
:纤维素是地球上数量最大的可再生性能源物质，纤维素的降解、转化是自然界碳素循环的重要环节，对这个过程的有效利用可望在能源、饲料和食物的持续供应上发挥巨大的作用。但是，至今纤维素的转化效率低，成本高，纤维素降解比较困难。所以新降解纤维素相关基因的发现与克隆是高效降解纤维素，实现纤维素生物转化的基础。
技术实现思路
:本专利技术通过宏基因组文库的功能筛选、基因克隆、基因测序等技术，在中国松材线虫中获得了一种新的降解纤维素相关基因，该基因被命名为Cen502。该基因全长约1，398bpDNA序列，共编码465个氨基酸残基。本专利技术通过基因表达实验，确定该基因具有降解多种纤维素底物的功能；对基因(cen502)的序列进行分析后发现，该基因与已有的降解纤维素基因具有一定的同源性，但是系统发育分析显示，该基因单独位于一个独立分支；所以，该基因属于降解纤维素的一个新基因，可以用来研究松材线虫致病机制，松材线虫与其宿主的相互关系，也可以作为潜在的纤维素生物转化的辅助因子。【具体实施方式】:1、专利技术人在中国南阳松材线虫疫区采集到了被感染的松木，并分离到了松材线虫。对该样品清洗，提取宏基因组，构建了宏基因组文库。2、根据文献，从松材线虫及其伴生菌的样品中提取总DNA，以柯斯质粒为载体构建了 I个含约9600个克隆的宏基因组文库，对文库进行活性筛选获得I个既表达CMCase活性又表达β-glucosidase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现I个潜在的可编码465个氨基酸的ORF (Open Reading Frame),其蛋白质产物与I个来源于BaciIIus polymyxa的beta-glucosidase基因bglA的同源性最高,两者的一致性为91%,相似性为87%。3、基因表达分析3.1载体构建首先克隆cen502基因，具体是将该基因的PCR产物回收后，直接连接到pMD18_T载体上，得到pMD18-T-Cen502。以pMD18-T_Cen502载体作为模板，设计一对引物5’ -ATCTGGATCCATGAAAAAGCTGTG-3’ 和 5’ -ATCGCTCGAGTCCGAGCAATTCAAAG-3 ’，分别引入BamHI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增。将扩增得到的1.4kb条带用内切酶BamHI和XhoI双酶切，载体pET30a (商购得到)同 样用BamHI和XhoI双酶切，回收大的片段，然后用T4DNA连接酶连接两个大的片段，转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，利用LB氨苄青霉素平板筛选重组转化子，提取重组质粒并用内切酶酶切鉴定。3.2大肠杆菌的转化大肠杆菌感受态的制备及转化按照常规方法进行。3.3异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性转化子分泌表达将阳性菌转接入50mLLB培养液，37 °C 150r/min培养过夜，至对数生长期(OD6000.7)加IPTG(0.1mM)诱导表达，再培养5h。然后，将其转到添加0.2%羧甲基纤维素(CMC)的LB培养基平板上培养一定的时间，用0.2%的刚果红染色20min，然后用Imol/LNaCl溶液洗涤20min，观察水解圈的大小。3.4表达产物SDS-PAGE电泳将阳性转化子从斜面接入到IOmL含有10 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C 200r/min振荡培养过夜，以2%的接种量转接至25mL新鲜液体LB培养基，继续于370C 200r/min 培养至 0D600=1 左右，在 30°C下采用 0.2mmol/L 的 IPTG诱导 5h。取 20 μ L 菌液加入5 μ L5 X SDS-PAGE电泳加样缓冲液，100°C水浴5min，取10 μ L进样，进行SDS-PAGE电泳分析，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色。SDS-PAGff电泳在51KD左右有表达蛋白带，通过收集条带得到纯化后的纤维素酶蛋白样品。3.5纤维素酶活性测试将表达出来的酶进行分离纯化，用纯酶测定的酶活。酶活计算公式:酶活=还原糖浓度X稀释倍数X 1000/作用时间XVXT纤维素酶活力的国际单位:ImL酶底物反应液Imin内产生相当于I μ g/mL葡萄糖的还原糖量规定为I国际单位(IIU)。降解纤维素酶活力采用3，5- 二硝基水杨酸法(DNS)测定:取1.5mL配好的CMC溶液与带有15mL刻度的试管中，每支试管分别加入离心后的酶液0.5mL混匀，放入50°C恒温水浴中糖化60min，取出加入DNS试剂2mL，沸水浴中煮沸lOmin，用蒸馏水定容至15mL，在冷水中冷却。测得0D550值，查阅葡萄糖标准曲线，求出含糖量。滤纸酶活性采用滤纸条作为底物来测定:取50mg(约lX6cm)滤纸条，将离心后的酶液吸取0.5mL，放入试管，加入1.5mLHAC-NaAC缓冲液，放入50°C恒温水浴中糖化60min，取出加入DNS试剂2mL，沸水浴中煮沸lOmin，用蒸馏水定容至15mL，在冷水中冷却。同上测得OD值，查阅葡萄糖标准曲线，求出含糖量。标准曲线的绘制:取7只带有15mL刻度的试管，按下表取试剂。表1测酶活时取试剂量的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素降解酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或者是与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有99%以上同源性的序列。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素降解酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID N0.1或者是与SEQID N0.1的氨基酸序列具有99%以上同源性的序列。2.权利要求1所述的纤维素降解酶的基因，其特征在于所述的基因氨基酸序列为SEQID N0.2。3.权利要求1所述的纤维素降解...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛秋红，张林，樊永欣，郑豪盈，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41