本发明专利技术公开了一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。本发明专利技术提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下1）的蛋白质：1）由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术突变野生型β-糖苷酶基因，得到β-糖苷酶突变体，与野生型相比，其在合成人参皂苷CK活力上有显著提高，因此具有较好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。本专利技术提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下1）的蛋白质：1）由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-糖苷酶活性的由1）衍生的蛋白质。本专利技术的实验证明，本专利技术突变野生型β-糖苷酶基因，得到β-糖苷酶突变体，与野生型相比，其在合成人参皂苷CK活力上有显著提高，因此具有较好的工业应用前景。【专利说明】β -糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用。
技术介绍
人参是传统的中医药材。据现代药理研究报道，人参具有增强人体免疫力，改善营养、抗衰老和减缓疲劳等功效。人参皂苷CK作为人参的主要有效活性成分之一，更易于被人体吸收，且具有促进恶性肿瘤细胞衰亡、遏制肿瘤扩散或恶化等医疗功效，因此具有极高的生产价值和应用前景。然而，人参皂苷CK在天然的人参提取物中并不存在，而是由其它人参皂苷成分(如人参皂苷Rb1, Rb2, Rd, Re和Rg1等)经由肠道菌代谢转化生成，因此在自然界中含量非常低。人参皂苷的转化过程主要包括将葡萄糖等单糖基团从主体结构水解除去，水解的方法有化学水解法和生物催化反应法等。化学方法虽然转化效率较高，但催化缺乏专一性，从而限制了其广泛的应用。而生物催化反应法，利用酶法实现人参皂苷CK合成的研究比较少，主要是真菌来源的一些酶蛋白的纯化和性质研究，如纯化自PaecilomycesBainier的葡糖苷酶,纯化自Thermuscaldophilus的葡糖苷酶等被发现有合成人参阜苷CK的活性，但一方面活性较低、转化过程中有中间产物累积；另一方面这些酶的基因序列均无报道，无法实现重组表达。在酶法合成人参皂苷CK的研究当中，不仅转化效率有待提高，而且同时应尽量减少甚至消除中间产物的累积，以最大程度加大人参皂苷CK的产量，降低下游分离纯化工作的难度。来自硫磺矿硫化叶菌的β -糖苷酶(LacS, β-Glycosidase)已被报道具有合成人参皂苷CK的能力，但转化效率有限，无法满足大规模生产的需求。利用该酶合成CK的优势在于:1、该酶已被重组表达，适于通过蛋白质工程手段进一步提高其催化效率；2、该酶的反应温度较高，热稳定性非常好，有助于在高温生产条件下完成产物合成，提高转化效率，降低生产过程中污染的可能；3、该酶催化合成人参皂苷CK的中间过程已被清楚阐释；4、该酶的晶体结构已被报道，为其进一步改造以及对酶突变体的分析提供了重要的参考信息。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种糖苷酶突变体及其编码基因。本专利技术提供的蛋白，命名为lacS-mut，是如下I)的蛋白质:1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β_糖苷酶活性的由I)衍生的蛋白质。上述序列表中的序列4由489个氨基酸组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的基因也是本专利技术保护的范围。上述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列3所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有β_糖苷酶活性蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有β -糖苷酶活性蛋白的DNA分子。上述严格条件为在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS 和 I X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。上述序列3均由1470个核苷酸组成，所述序列3的编码区为自5’末端第1-1470位核苷酸。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，具体为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入载体pET28a的NheI和XhoI识别位点间得到的重组载体。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为β-糖苷酶中的应用也是本专利技术保护的范围。上述蛋白在生`产人参皂苷CK中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种生产人参皂苷CK的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:I)发酵上述重组菌，收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液；2)将所述上清液与人参皂苷底物Rb1在MC缓冲液中反应，得到人参皂苷CK。上述方法中，I)所述发酵在IPTG诱导下进行；2)所述MC缓冲液为pH值为5.5的MC缓冲液；所述pH值为5.5的MC缓冲液具体由终浓度为200mM磷酸氢二钠、终浓度为IOOmM柠檬酸和水组成。本专利技术的实验证明，本专利技术突变野生型糖苷酶基因，得到糖苷酶突变体，与野生型相比，其在合成人参皂苷CK活力上有显著提高，因此具有较好的工业应用前景。【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、β -糖苷酶突变体及其编码基因的获得1、β -糖苷酶及其编码基因的获得提取硫横矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus) (ATCC 35091, DSM 1616)的基因组 DNA 并以其为模板，以 5，-atggctagcatgtactcatttccaaatagc-3，(forward) and 5，-gtgctcgagttagtgccttaatggctttac-3’(reverse)为引物进行 PCR扩增。PCR扩增条件如下:先 95°C预变性 4min，然后 95°C 45s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 个循环；最后 72°C延伸IOmin0回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得约1470bp大小的片段。将上述获得的PCR产物用NheI和XhoI双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体(Novagen公司，编号69864-3)用T4连接酶(购自宝生物公司)16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态细胞，获得重组菌。提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，该PCR产物的基因命名为lacS，其核苷酸序列为序列表中的序列1，通过比对，其为硫磺矿硫化叶菌的糖苷酶IacS的基因，该基因编码的蛋白命名为LacS,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。将含有该PCR广物的质粒命名为pET28a-lacS，该质粒为将序列表中的序列I插入pET28a载体的NheI和XhoI双酶切位点间得到的载体。2、突变得到β-糖苷酶突变体在β-糖苷酶IacS基因的基础上，利用易错PCR的方法，构建随机突变文库。主要是通过改变PCR扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β?糖苷酶活性由序列4衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁朝宁，唐双焱，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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