一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法技术

本发明专利技术涉及一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法。本发明专利技术具体涉及一种重组表达载体，其包含(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列、(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列、和(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，还涉及包含所述重组表达载体的重组宿主细胞和重组纤维素降解菌、其制备方法及应用。本发明专利技术的方法能在提高β-葡萄糖苷酶产量的同时缩短发酵周期，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和发酵领域。具体而言，本专利技术涉及一种采用基因工程方法重组表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的方法、用于该方法中的菌株及其应用。
技术介绍
纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用纤维素进行生物转化生产燃料乙醇等化学品，对于解决人类面临的能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有极其重要的现实意义。降解纤维素的纤维素酶是一个多酶复合体系，包含内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。这三种酶协同作用将纤维素降解成葡萄糖。其中β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，其英文名为β-glucosidase(缩写BGL)，在纤维素酶水解纤维素的过程中可以水解纤维二糖从而释放出葡萄糖，成为纤维素彻底水解的关键步骤。在纤维素水解过程中主要存在以下几方面问题：首先，β-葡萄糖苷酶活性受水解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其它酶的抑制剂，从而使整个纤维素的水解过程受到抑制；其次，在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量都很低(除黑曲霉外)，如里氏木霉分泌的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶含量还不到1％，远达不到实际应用的水平；再次，在反应过程中，由于热抑制作用，大量的β-葡萄糖苷酶活性消失。因此，β-葡萄糖苷酶的活力一般比内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶低一个数量级以上，成为纤维素降解的限速酶(王振宇等，高温厌氧菌产纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶的活性，大连轻工业学院学报，2005，24(2)，110～114)。目前应用最广泛的纤维素酶生产菌株大多是里氏木霉(Trichodermareesei)的优良突变株，它能分泌产生内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，包含了完整的纤维素水解酶系(PenttilaME等，ExpressionoftwoTrichodermareeseiEndoglucanaseintheYeastSaccharomycescereviae(两种里氏木霉内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的表达)，Yeast.Vol.3，1987(3)：175–185)。由于天然里氏木霉菌株中的β-葡萄糖苷酶产量低，造成了纤维素的水解过程受限。因此，提高纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的活力，是提高纤维素酶水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一。有研究者使里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中重组表达，其酶活力随诱导时间的增加而提高，但其发酵周期达8天以上(“里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达”，授权公告号CN102220369B)。也有研究者通过融合表达的方式在里氏木霉中过量表达β-葡萄糖苷酶，可得到酶活力几倍于原始菌株的产量，但其发酵周期长达6天以上(“提高具有生物学活性之多肽的分泌的方法”，授权公告号CN101516906B)。现有技术中的这些方法普遍存在发酵周期过长的不足。因此，本领域迫切需要开发出一种能在提高酶活力的同时缩短发酵周期的纤维素降解微生物(例如基因工程化的里氏木霉)，以大大降低生产成本，提高纤维素酶的竞争力。
技术实现思路
本专利技术的方法能在提高β-葡萄糖苷酶产量的同时提前产酶周期，克服现有技术里氏木霉中β-葡萄糖苷酶发酵周期长，产酶量低等不足，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。在本专利技术的第一方面中，提供了一种融合蛋白或其编码序列，所述融合蛋白包含：(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段；(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段；和(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，例如由SEQIDNO:4所示序列编码。在本专利技术的第二方面中，提供了一种重组表达载体，其包含：(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列；(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列；和(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列的编码序列(例如SEQIDNO:4所示的序列)。在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体还包含选自下组的一种或多种元件：(i)启动子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)启动子(例如SEQIDNO:1所示序列的启动子)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CbhII)、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉β-木聚糖酶里氏木霉β-葡糖苷酶启动子、米曲霉TATA淀粉酶启动子、米曲霉碱性蛋白酶启动子、米曲霉丙糖磷酸异构酶、黑曲霉中性α-淀粉酶启动子、黑曲霉糖化酶启动子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶启动子；在酵母中，有用的启动子包括：酿酒酵母烯醇化酶启动子(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶启动子、酿酒酵母醇脱氢酶启动子/甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶启动子；(ii)信号肽编码序列，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)信号肽(例如SEQIDNO:2所示序列的编码序列)、米曲霉淀粉酶信号肽，黑曲霉糖化酶信号肽，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶信号肽的编码序列；(iii)前导序列编码序列；(iv)终止子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I(CbhI)终止子(例如SEQIDNO:6所示序列的终止子)、米曲霉淀粉酶终止子、黑曲霉糖化酶终止子、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶终止子；(v)标记基因，如乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(pyrG)、潮霉素磷酸转移酶基因(hph)，构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argB)、硝酸还原酶(niaD)、邻氨基苯甲酸和酶(trpC)；(vi)聚腺苷酸化序列，例如其获自选自下组的酶的基因的聚腺苷酸化序列：米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶；以及CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)类似因子,GATA转录因子等；(vii)转录激活因子。在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体的基本骨架来自：pCAmbia1300质粒、pCAmbia2300质粒、pCAmbia1301质粒或pBIN19质粒；优选地，所述重组表达载体是pAZ193。在本专利技术的一些实施方式中，上述方面中的所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段编码序列选自：源自纤维素降解细菌的天冬氨酸蛋白酶或其它活性片段的编码序列，例如源自木霉(如哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichodermareesei))、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉(Botr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白或其编码序列，所述融合蛋白包含：(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段；(b)β‑葡萄糖苷酶或其活性片段；和(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，优选由SEQ ID NO:4所示序列编码。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白或其编码序列，所述融合蛋白包含：
(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段；
(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段；和
(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列，优选由SEQIDNO:4所示序列编码。
2.一种重组表达载体，其包含：
(a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列；
(b)β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列；和
(c)任选位于(a)和(b)之间的连接序列的编码序列，优选SEQIDNO:4所示的序
列。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含
选自下组的一种或多种元件：
(i)启动子；
(ii)信号肽编码序列；
(iii)前导序列编码序列；
(iv)终止子；
(v)标记基因；
(vi)聚腺苷酸化序列。
4.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基本
骨架来自：pCAmbia1300质粒、pCAmbia2300质粒、pCAmbia1301质粒或pBIN19
质粒；优选地，所述重组表达载体是pAZ193。
5.如权利要求1所述的编码序列或如权利要求2所述的重组表达载体，其特
征在于，所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段编码序列选自：源自纤维素降解细菌
的天冬氨酸蛋白酶或其它活性片段的编码序列，优选源自木霉，更优选源自哈茨
木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichodermareesei)，青霉，曲霉，毛

\t霉，葡萄孢霉(Botrytis)，纤维单胞菌属(Cellulomonas)，纤维弧菌属(Cellvibrio)，噬
胞菌属(Cytophaga)，产琥珀酸拟杆菌(Bacteroidessuccinogenes)，牛黄瘤胃球菌
(Ruminococcusflavefaciens)，白色瘤胃球菌(R.albus)，和/或溶纤维丁酸弧菌
(Butyrivibriofibrisolvens)；优选所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段包含SEQIDNO:
3或7所示的序列或其同源序列编码的氨基酸序列或所述氨基酸序列经过取代、
缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选经过保守性取代至少一个氨基
酸后得到的序列。
6.如权利要求1所述的编码序列或如权利要求2所述的重组表达载体，其特
征在于，所述β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列选自：源自纤维素降解细菌
的β-葡萄糖苷酶或其活性片段的编码序列，优选源自木霉，更优选源自哈茨木霉
(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichodermareesei)，青霉，曲霉，更优选
源自黑曲霉(Aspergillusniger)，毛霉，葡萄孢霉(Botrytis)，纤维单胞菌属<...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾阿娜，王刚，冯奇，许骏，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31