一种β‑木糖苷酶体内酶聚集体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种β‑木糖苷酶体内酶聚集体的制备方法，包括如下步骤：(1)将连接肽与双亲短肽拼接，构建得到表达载体；所述双亲短肽为ELK16；(2)将β‑木糖苷酶编码基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达β‑木糖苷酶–短肽融合蛋白的工程菌；(3)将上述工程菌诱导表达，并对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即获得β‑木糖苷酶体内酶聚集体。相比于常规表达获得的ThXylC，本发明专利技术所得ThXylC‑ELK16活性酶聚集体，比酶活和催化效率得到了提高，且其热耐受性也明显提高。体现出该方法具有在生产中推广应用的巨大潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程、生物催化领域。本专利技术具体涉及一种通过在β-木糖苷酶(ThXylC)末端添加双亲短肽，大幅度提高该β-木糖苷酶比酶活、催化效率和热耐受性的方法。
技术介绍
工农业生产中常常需要热耐受性较好的酶作为催化剂进行反应。这是因为与常温酶相比，热耐受性好的酶具有如下优势：(1)反应速率加快；根据范霍夫规律(van’tHoff)，在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，反应速率响应提高2-4倍。(2)催化过程在高温下进行，能改善底物如淀粉、纤维素、脂类等的溶解性和可利用性，降低化合物的粘度而有利于物质扩散和混合；(3)在反应温度高于50℃时，大大减少了杂菌生长的机会，从而减少了微生物对产物的污染，有利于简化产物分离步骤。基于上述优点，热耐受性好的酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域都具有广阔的应用前景。通常来讲，获得热耐受性良好的酶的方法有3种，(1)从天然极端微生物中筛选获得(SharmaPK,etal,Gene2012,491:264-271)，(2)采用基因工程方法，如定点突变、定向进化、饱和突变等方法，获得酶突变体(LiS,etal,ComputStructBiotechnolJ.2012,2:e201209017)(3)采用酶固定化等工程方法，提高酶催化过程的稳定性(K.SteinerandH.Schwab,Comput.Struct.Biotechnol.J.2012,2,e201209010)。此外，近年来有报道通过在目标酶的N端或C端融合表达某类双亲短肽例如口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1、人β-淀粉样蛋白Aβ42(F19D)(García-Fruitós,Elena,etal.MicrobialCellFactories4.1(2005):207-219)，麦芽糖结合蛋白突变体(ArieJP,MiotM,SassoonN,BettonJM:MolMicrobiol2006,62:427-437)，纤维素结合域(NahálkaandJozef.Journalofbiotechnology134.1(2008):146-153.)，ELK16、L6KD和18A(LinZ,ZhouB,WuW,etal.Faradaydiscussions,2013,166:243-256.)，以优化酶的催化特性。如在单加氧酶(lipoxygenase)的N端融合表达一段自聚集短肽(Self-assemblypeptide，SAP)，该酶在50℃的热稳定性从10min延长至46min(LuXY,etal,Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97,9419–9427)。本课题组前期研究中，通过在腈水解酶C端引入18A短肽，也成功的将腈水解酶在50℃的半衰期从13h延长至56h(YangX,etal,RSCAdvances2014,4:60675-84)。但上述这些通过在目标蛋白末端融合表达短肽的方法，仅能部分提高酶的稳定性，而对酶的最适反应温度并没有影响，也即最适酶促反应温度并没有变化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高β-木糖苷酶热耐受性的方法，此处热耐受性包括酶的最适酶促反应温度和酶的热稳定性。更具体的，本专利技术通过在β-木糖苷酶的C端或者N端融合表达双亲性短肽ELK16来实现β-木糖苷酶的热耐受性的提高。本专利技术的另一目的在于提供一种获得具有较好温度耐受性的β-木糖苷酶活性聚集体的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：(1)将连接肽与双亲短肽拼接，构建得到表达载体；所述双亲短肽为ELK16；(2)将β-木糖苷酶编码基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达β-木糖苷酶–短肽融合蛋白的工程菌；(3)将上述工程菌诱导表达，并对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即获得β-木糖苷酶体内酶聚集体ThXylC-ELK16。所述表达载体为可在微生物中过量表达的载体。所述的连接肽序列包括常见的连接融合蛋白表达所用的连接肽，包括但不限于PT-linker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)、(GGGGS)3、(Gly)6、(Gly)8、(EAAAK)n(n＝1-3)。所述的连接肽与双亲短肽的拼接顺序可以是连接肽-双亲肽或者双亲肽-连接肽，相应的双亲肽与β-木糖苷酶融合表达，双亲肽可位于β-木糖苷酶的C端或者N端。所述连接肽与双亲短肽拼接后的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。所述的β-木糖苷酶基因，并不严格要求恰好为β-木糖苷酶编码基因的开放阅读框，只要该序列插入表达载体可正常转录翻译出β-木糖苷酶编码氨基酸序列即可。优选β-木糖苷酶编码基因的开放阅读框。所述β-木糖苷酶基因可选自，但不限于ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27。步骤(3)所述的受体菌，只要步骤(1)所述的表达载体可在其体内表达即可，包括但不局限于E.coliDH5α,E.coliJM109，E.coliJM110，E.coliTOP10,E.coliBL21，E.coliBL21(DE3)，E.coliBL21(DE3)/pLysS，E.coliBL21Rosetta，E.coliBL21Rosetta(DE3)，优选E.coliBL21(DE3)。步骤(3)所述沉淀采用缓冲液洗涤进行纯化。步骤(2)所述的转化方法包括但不局限于热激法，CaCl2方法、电转化方法等方法。步骤(3)所述对细胞进行破壁处理方法，包括但不局限于超声破碎法、高压破碎法、溶菌酶破壁法等，优选超声破碎法。以对硝基苯基-β-D-木糖苷(pNPX)为底物，测定ThXylC和ThXylC-ELK16的酶促动力学参数的以及进行酶学性质的表征。其反应体系如下：pH为4.0～8.0的缓冲液，初始浓度为1mmol/L～10mmol/L的对硝基苯基-β-D-木糖苷(pNPX)，优选为4mmol/L，反应温度为45～85℃，ThXylC和ThXylC-ELK16优选温度分别为65℃和70℃。所述的缓冲液无特殊要求，只要能有效调节缓冲液pH值即可，所述缓冲液包括但不限于乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲液。优选pH值为6.5的磷酸钾缓冲液。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过双亲短肽诱导β-木糖苷酶在大肠杆菌体内聚集，通过常规的细胞破碎离心即可获得纯度约95％的活性β-木糖苷酶聚集体。由于本专利技术活性聚集体具有强的机械操作稳定性，可以承受超声，高压或其他强烈的物理破碎细胞过程，因此可通过简单的细胞破碎、离心操作即可获得纯度较高的蛋白样品，相较于原可溶表达β-木糖苷酶(记为ThXylC)的亲和纯化更为简单。(2)本专利技术所得的ThXylC-ELK16相较于ThXylC水溶性较差，有利于长期储存；催化特性得到明显改善，有利于推进β-木糖苷酶的工业应用，具有广阔的应用前景。(3)相比于常规表达获得的ThXylC，本专利技术所得ThXylC-ELK16活性酶聚集体，比酶活和催化效率得到了提高，且其热耐受性(包括最适催化反应温度和温度稳定性)也明显提高。附图说明图1为pET-ELK质粒示意图。图2SDS-PAGE分析β-木糖苷酶表达纯化(A)ThXylC蛋白样品，M,蛋白分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑木糖苷酶体内酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将连接肽与双亲短肽拼接，构建得到表达载体；所述双亲短肽为ELK16；(2)将β‑木糖苷酶编码基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达β‑木糖苷酶–短肽融合蛋白的工程菌；(3)将上述工程菌诱导表达，并对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即获得β‑木糖苷酶体内酶聚集体。

【技术特征摘要】
1.一种β-木糖苷酶体内酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将连接肽与双亲短肽拼接，构建得到表达载体；所述双亲短肽为ELK16；(2)将β-木糖苷酶编码基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得能表达β-木糖苷酶–短肽融合蛋白的工程菌；(3)将上述工程菌诱导表达，并对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即获得β-木糖苷酶体内酶聚集体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的连接肽序列包括但不限于PT-linker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)、(GGGGS)3、(Gly)6、(Gly)8、(EAAAK)n(n＝1-3)。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述连接肽与双亲短肽拼接后的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爽，徐天旺，杨晓锋，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44