本发明专利技术的目的是提供一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，该黑曲霉菌株是首先将来外源的α-葡萄糖苷酶基因在黑曲霉宿主菌中过表达，构建得到表达α-葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌，然后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得的。本发明专利技术的突变菌黑曲霉Su-A2，其保藏编号为CCTCC NO：M2015681。本发明专利技术提供的α-葡萄糖苷酶活力达到20.45u/ml，蛋白表达量为4.13g/L，比突变前分别提高了39.3％和18％，可以进行广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌 株。 技术背景 葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释 放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷酶来源广泛，几 乎所有以碳水化合物为能源的具有细胞结构的生物体内都有所存在。根据具有糖类活性的 酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database，CAZy)依据蛋白质晶体结构的同源性 与功能的相似性所进行的归类，可将现已发现的糖苷水解酶分为133个糖苷水解酶家族 (GH1~GH133)，其中，葡萄糖苷酶主要分布在GH1、GH3、GH4、GH5、GH9、GH13、GH17、GH30、 GH31、GH63、GH97、GH116与GH122等糖苷水解酶家族中。由于葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，因此，其所对应的葡萄糖苷酶 分别被称为α_葡萄糖苷酶与β_葡萄糖苷酶。根据CAZy的具体分类，α-葡萄糖苷酶主要分布 于6財、6!113、6!131、6册3、6!197以及6!1122五个家族中 ；而0-葡萄糖苷酶主要分布于6!11、6!13、 GH5、GH9、GH17、GH30、GH116 等七个家族中。 生产α-葡萄糖苷酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精 所使用的α-葡萄糖苷酶主要来自黑曲霉(Aspergillus niger)。由于能分泌α-葡萄糖苷酶 的野生菌株的生产能力普遍较低，因此如何进一步筛选出高产α-葡萄糖苷酶的生产菌株成 为当前国内外研究的热点。【
技术实现思路
】本专利技术的目的是提供一种高产α_葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。申请人首先将来外源 的α_葡萄糖苷酶基因在黑曲霉宿主菌中过表达，构建得到表达α-葡萄糖苷酶的黑曲霉工程 菌，然后通过基因敲除手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得葡萄糖苷酶产量明 显提高的突变菌株，为该酶的广泛应用奠定了基础。本专利技术一方面提供了一种黑曲霉工程菌，其携带有表达α-葡萄糖苷酶基因的重组 质粒。 所述的α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQIDNO: 1;其编码基因的序列为SEQID N0:2〇 本专利技术一方面提供了一株突变菌黑曲霉Su_A2(AspergillusnigerSu_A2)，已于 2015年11月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0：M2015681〇本专利技术所述黑曲霉Su-A2在生产α-葡萄糖苷酶中的应用。本专利技术构建的黑曲霉工程菌Su-Al，在30L发酵罐发酵条件下其α-葡萄糖苷酶活力 达到14.68u/ml，蛋白表达量为3.5g/L。为了进一步提高其产酶能力，本专利技术通过基因敲除 手段敲除宿主菌自身的糖化酶基因，筛选获得的突变菌株黑曲霉Su-A2,其α-葡萄糖苷酶活 力达到20.45u/ml，蛋白表达量为4.13g/L，比突变前分别提高了39.3 %和18 %，可以进行广 泛应用。【附图说明】 图1为质粒pGAU图谱；图 2 为质粒pMD18T-pyrG图谱。【具体实施方式】本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:ALAB0RAT0RY MANUAL，3nd Ed.(Sambrook，2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY(Ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载 的技术方案的基础上，采用本领域常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施 例的限定。下面结合【具体实施方式】对本专利技术进行详细描述。实施例Ια-葡萄糖苷酶基因的获得根据公共基因数据库中的基因序列，设计引物从黑曲霉基因组中PCR扩增获得α-葡萄糖苷酶基因AglUl(核苷酸序列为SEQIDΝ0:1)，其编码的氨基酸序列为SEQIDΝ0:2。 PCR引物和反应条件如下：引物1(F) :ATGGTGAAGTTGACCGATCTC引物2(R) :CTACCATTCTAGCACCCAGTT 反应条件为:94°C变性5min;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸3min，30个 循环后，72°C保温10min。琼脂糖电泳结果显示，AglUl基因大小为3127bp。 实施例2重组载体构建 PCR扩增α-葡萄糖苷酶基因，引物两端引入Xbal位点。引物序列如下：引物3(F) ：GCTCTAGAATGGTGAAGTTGACCGATCTC引物4(R) ：GCTCTAGACTACCATTCTAGCACCCAGTTPCR反应条件为：94°C变性5min;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸3min， 30个循环后，72°C保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，AglUl基因为大小3127bp的片段。 将上述获得的α-葡萄糖苷酶AglUl片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶 Xbal单酶切，酶切条件如下： 37°C水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ulddH20。用T4DNA 连接酶进行连接，连接体系如下： 22°C连接lh，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37°C培养过夜后长出单 菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有α-葡萄糖 苷酶基因AglUl的重组载体pGAU-AglUl。实施例3α-葡萄糖苷酶AglUl的重组表达 原生质体制备:接种黑曲霉宿主菌Su2-1于PDA+U平板，30°C培养5-7d。割取2cmX 2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U培养基中，30°C培养24h生长菌丝体，用于转化。将长 好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30°C、lOOrpm培养2-3h。将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心lOmin获得原生质体。转化:原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生 质体浓度达到1〇8。200ul原生质体中加入10ul准备好的质粒，加入50ul25 %的PEG6000，冰 浴20min，再加入2ml25 %的TOG6000室温放置5min，加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀。倒入 50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30°C培养箱 中倒置培养5d。 转化子筛选:培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30°C培 养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30°C培养5-7d。每个转化子割取2cm X2cm大小的菌块，分别接种至50ml液体摇瓶培养基中发酵，32°C培养5d，每天加入适量氨 水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测，筛 选出有明显蛋白条带表达的重组菌株，即为阳性转化子。 申请人将其中一个阳性转化子命名为黑曲霉Su_Al(Aspergillus niger Su-Al)。实施例4U缺陷型菌株筛选 将上述黑曲霉Su-Al接种至P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黑曲霉工程菌，其特征在于，所述的黑曲霉工程菌携带有表达α‑葡萄糖苷酶基因的重组质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，徐娟，张霞，刘文瑶，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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