本发明专利技术涉及一种高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用，所述β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸，耐11%酒精，该β-葡萄糖苷酶由保藏编号为CGMCC No.7799、保藏名称为曲霉（Aspergillus sp.）BG30的棘孢曲霉菌株发酵获得，其制备方法按如下步骤进行：（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；（2）将孢子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE-阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得β-葡萄糖苷酶。本发明专利技术的高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸和11%酒精，具有较强的增香功能及转糖苷酶活性，用作酶法合成烷基糖苷等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种高耐受性0-葡萄糖巧酶及其应用，属于发酵工程与生物技术领 域。
技术介绍
[000引 0 -葡萄糖巧酶（0-Glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，又称0-D-葡萄糖巧水解酶，它 能够水解结合于末端非还原性的0-D-葡萄糖巧键，同时释放出0-D-葡萄糖和相应的配 基，该种酶存在于许多植物体，还存在于一些酵母、霉菌、木霉菌属及细菌甚至是昆虫体内。 0-葡萄糖巧酶可W将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质0-糖巧水解为具有浓郁天然风 味的香气物质。 0-葡萄糖巧酶的可运用领域广泛：可W用在果汁行业用于增香脱苦，很多果汁 中含有很多风味前体物质一一 0 -糖巧，只要通过一些酶的作用就能使该些糖巧配基挥发 释放，起到增香的作用，在众多的研究中发现，棘抱曲霉产的葡萄糖巧酶对苹果汁、巧樣汁、 茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研究的热点，对于脱苦的原理和增香 类似，例如在青梅汁中，葡萄糖巧酶可W将其中的苦杏仁巧分解为苯甲醒及氨氯酸和两分 子的葡萄糖，该就使青梅的苦味大大减少；葡萄糖巧酶的脱苦还可W用在巧橘、橄揽等具有 一定苦味的水果中。 另外，还可W用于一些糖巧类前体的分解来生产分解后产物，例如低聚龙胆糖的 生产、大豆异黄酬的生产，该两种产物的前体都是W结合型的糖巧形式存在。除了W上该些 领域，0-葡萄糖巧酶的应用领域还很宽泛，比如制造生物酒精，通过基因技术来达到防治 病虫害的目的，W及一些天然染料的生产，动物饲料的生产甚至是医药领域。 目前，国内外对于0-葡萄糖巧酶的研究不少，但现有技术中产0-葡萄糖巧酶的 棘抱曲霉菌株胞外0-葡萄糖巧酶活性不高，所获得的0-葡萄糖巧酶的耐受性不佳，如不 耐高温、高酒精度、高盐和高醋酸环境，导致其应用领域受限，本申请的专利技术人获得一株具 有较高胞外0-葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌株，发酵获得的0-葡萄糖巧酶能耐高温、耐 高酒精度、耐高盐和高醋酸环境，应用领域广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种由具有较高胞外0 -葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌 株发酵获得的0-葡萄糖巧酶，该0-葡萄糖巧酶能耐高温、耐高酒精度、耐高盐和高醋酸 环境。 本专利技术另一个目的是提供该棘抱曲霉菌株发酵产生的0-葡萄糖巧酶的若干应 用。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是； 高耐受性0-葡萄糖巧酶，所述0-葡萄糖巧酶耐65-100°C高温，耐质量浓度4~6%的 氯化钢，耐质量分数3%的醋酸，耐体积分数11%W上的酒精，该0 -葡萄糖巧酶由保藏编号 为CGMCCNo. 7799、保藏名称为曲霉Uwer知Wusw. )BG30的棘抱曲霉菌株发酵获得，其 制备方法按如下步骤进行： (1) 将曲霉（知Wus5/7. )BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水 洗下斜面培养基上的抱子； (2) 将抱子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得0 -葡萄糖巧酶 粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE-阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得 0-葡萄糖巧酶。 曲霉（AspergillusSP. )BG30,保藏单位；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNo. 7799,保藏日 期2013年6月28日。 曲霉Uwer知Wus )BG30的菌落形态特征；在麦芽汁琼脂培养基上生长快， 25°C黑暗条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产抱结构大量形成，分生抱子头紫 褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生抱子梗大，宽8. 5-11. 0ym，褐色，壁光滑， 顶囊球形，直径33-42ym，全部表面可有；产抱结构单层，瓶梗6-10*ym，分生抱子楠圆形， 少数球形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0ym，未见有性抱子。 培养条件影响曲霉Uwer知)BG30的繁殖，进而影响其生产0 -葡萄糖 巧酶的能力，步骤（1)中增殖培养的条件为温度28~30°C，培养时间96~120h;步骤（2)中发 酵培养的条件为温度28~30°C，培养时间96~120h。[001引 0 -葡萄糖巧酶作为胞外产物，发酵完成后，0 -葡萄糖巧酶存在于发酵液中，通 过常规的酶分离纯化方法即可分离纯化获得高酶活的0-葡萄糖巧酶。 培养基的种类也是影响棘抱曲霉菌株繁殖的重要条件，步骤（1)中斜面培养基的 组成为；葡萄糖5.Og，氯化钢3.Og，硝酸钟3.Og，磯酸氨二钟0. 06g，硫酸铜0. 004g，款皮 10.Og，酒石酸钟钢0. 005g，氯化铁0. 005g，硫酸铺0. 005g，琼脂20.Og，乳糖10.Og，蒸馈水 1000血，抑值5. 5~6. 0,所述斜面培养基配置好后于0. 08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉 BG30进行培养。 步骤（2)中产酶培养基的组成W1L培养基计为；款皮34~36g，硫酸锭1. 8~2.Og， M拆〇4 ? 7&0 0. 4~0. 5g，蛋白腺 1. 2~1. 5g，FeS〇4 ? 7&0 0. 008~0.Olg，葡萄糖 2g，抑 5. 45~5. 55。 本专利技术的高耐受性0-葡萄糖巧酶的应用，在催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏 血酸葡萄糖巧中的应用，催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏血酸葡萄糖巧的具体工艺为：每 lOOmLW水做溶剂的反应体系中加入3-6g抗环血酸、15-25g葡萄糖和Ig酶保护剂硫脈，再 按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于55-65°C反应2-2.化。 本专利技术的高耐受性0-葡萄糖巧酶的应用，在催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧中 的应用，催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧的具体工艺为：每lOOmLW水做溶剂的反应体系中 加入乳糖30-45g和酶稳定剂硫脈Ig，再按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于28-70°C反 应5-10分钟。 本专利技术的高耐受性0-葡萄糖巧酶还可W用于杨梅酒、擲猴桃酒、半甜型擲猴桃 酒、干型擲猴桃酒、擲猴桃白兰地酒的脱苦去涩，W及用于杂粮酒发酵增香、洋河大曲酒增 香、莲子酒增香、茶叶增香；用于调料品增香或食品增香，W及用于化妆品或护肤品的增香。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是；本专利技术的高耐受性e-葡萄糖巧酶耐 65-100°C高温，耐质量浓度4-6%的氯化钢，耐质量分数3%醋酸和体积分数11%W上的酒 精，具有较强的增香功能及转糖巧酶活性，可W用作酶法合成烷基糖巧；还可W用于多种果 酒、白酒、调料品和食品的增香化及化妆品和护肤品的增香，应用范围广，增香效果突出。【附图说明】 图1;分离纯化并脱盐冻干后0-葡萄糖巧酶的SDS-PAGE电泳银染结果； 图2 ;不同抑对发酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影响； 图3 ;不同抑对精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影响； 图4 ;温度对发酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影响； 图5 ;温度对精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影响； 图6 ; 0 -葡萄糖巧酶对pNPG的酶动力学双倒数图； 图7;酒精作用下0-葡萄糖巧酶对pNPG的酶动力学双倒数图； 图8 ; 0 -葡萄糖巧酶催化合成抗坏血酸葡萄糖巧反应混合物薄层层本文档来自技高网...
【技术保护点】
高耐受性β‑葡萄糖苷酶，其特征在于：该β‑葡萄糖苷酶由保藏编号为CGMCC No.7799、保藏名称为曲霉（Aspergillus sp.）BG30的棘孢曲霉菌株发酵获得，其制备方法按如下步骤进行：（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；（2）将孢子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β‑葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE‑阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得β‑葡萄糖苷酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁辉，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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