本发明专利技术公开了一种组合物，其含有一种酶，该酶具有葡萄糖苷酶的活性，在纤维素降解中提供降解的功能，该酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。编码酶的DNA分子。重组载体，其含有DNA分子和与其连接的用于表达的调节序列。宿主细胞，其含有DNA分子或重组载体。本发明专利技术的氨基酸序列SEQ ID NO：2、3和4所示的β-葡萄糖苷酶突变体，与野生型β-葡萄糖苷酶相比，热稳定性提高，在酶系复配中能够提高复配酶液整体水解率。
【技术实现步骤摘要】
一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶，和通过基因定点突变的方法获得β-葡萄糖苷酶的突变体和一些耐热性提高的β-葡萄糖苷酶的突变体，以及β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体的在纤维素降解中的应用。
技术介绍
由于能源危机日益严重，可再生且环保效果显著的木质纤维素糖化工艺越来越受到人们的关注。利用纤维素酶降解木质纤维素产生葡萄糖，进而发酵生产包括乙醇在内的生物基产品对社会经济发展具有重要的现实意义。然而，由于纤维素酶降解天然纤维素底物的效率低，成本高，因此由纤维素转化为生物燃料的过程依然具有很大挑战性。同时，由于底物的特异性，以及纤维素酶发酵液酶系的不平衡限制了其应用。在纤维素降解过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化为葡萄糖的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术提供一种β-葡萄糖苷酶，本专利技术的β-葡萄糖苷酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，能用于降解纤维素。同时，为了提高β-葡萄糖苷酶的耐热性，本专利技术对野生型β-葡萄糖苷酶突变体进行了突变，得到了几种耐热性显著提高的β-葡萄糖苷酶的突变体。本专利技术提供的技术方案为：一种组合物，其含有一种酶，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该由(a)衍生的蛋白质的氨基酸的序列选自：SEQIDNO:2、3和4。目前有一株经过诱变育种筛选到的能大量高产β-葡萄糖苷酶的桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16，桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16的保藏号为CGMCCNo.8339，保藏时间为：2013年10月15日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本专利技术的申请人首先将桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16的全基因组测序，通过生物信息学方法以所有霉菌属产生的β-葡萄糖苷酶蛋白序列建库，利用blastx在桧状青霉全基因组中进行搜索，并进行归类最终得到表达量最高的胞外分泌β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。如SEQIDNO:1所示的β-葡萄糖苷酶的表达量最高，且活性达到20IU/mL以上。高表达量、高活力的β-葡萄糖苷酶可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。本专利技术提供的所述酶与其他用于降解纤维素比如β-1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶的酶共同作用，用于降解纤维素。本专利技术提供的酶也可单独用于降解纤维二糖。优选的是，所述的组合物中，所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第335位的天冬酰胺、第341位的谷氨酰胺和第343位的丝氨酸均被取代为色氨酸(N335W、Q341W和S343W)，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。优选的是，所述的组合物中，所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列第336位的丝氨酸被取代为苯丙氨酸、第341位的谷氨酰胺被取代为色氨酸和第343位的丝氨酸被取代为色氨酸((S336F、Q341W和S343W)，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。优选的是，所述的组合物中，所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第341位的谷氨酰胺和第343位的丝氨酸均被取代为色氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术提供的氨基酸序列SEQIDNO:2所示的β-葡萄糖苷酶突变体与野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQIDNO:1)相比，仍然具有葡萄糖苷酶的活性，能够用于降解纤维素，且酶活大致相同，而热稳定性显著提高，使其在酶系复配中能够提高复配酶液整体水解率。本专利技术还提供氨基酸序列SEQIDNO:3和氨基酸序列SEQIDNO:4的所示的β-葡萄糖苷酶突变体，与β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQIDNO:1)相比，仍然具有葡萄糖苷酶的活性，能够用于降解纤维素，且酶活大致相同，而热稳定性极其显著提高，使其在酶系复配中能够提高复配酶液整体水解率。热稳定性提高使得相对于野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQIDNO:1)，氨基酸序列SEQIDNO:3和氨基酸序列SEQIDNO:4的所示的β-葡萄糖苷酶突变体在更适应于工业化生产。可将野生型β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQIDNO:1)单独用于酶系复配从而用于降解纤维素，也可将β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体(氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4)这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。本专利技术还提供一种DNA分子，所述DNA分子编码如上的所述酶，该DNA分子的序列选自：SEQIDNO:5、6、7和8。由于氨基酸密码子存在简并性，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子(synonymouscodon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，仍然能编码出原氨基酸。密码的简并也使DNA分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本专利技术所述的DNA分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码所述酶的可能的多核苷酸序列，这里不在一一列举。本专利技术也提供一种重组载体，其含有能够编码所述酶的所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列，该DNA分子的序列选自：SEQIDNO:5、6、7和8，本专利技术中使用的用于表达的调节序列为pET系列载体，当然，也可以使用其他适于编码所述酶的核苷酸序列的表达载体，它们能够在多种真核宿主细胞和原核宿主细胞中表达。本专利技术还提供给宿主细胞，该宿主细胞包括能够编码所述酶的所述的DNA分子或所述的重组载体，所述的重组载体所含的DNA分子能够编码所述酶，该DNA分子的序列选自：SEQIDNO:5、6、7和8。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为大肠杆菌细胞。本专利技术还提供一种产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法，包括：步骤一、从桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16中克隆得到如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，并将所述多核苷酸序列连接到用于表达的调节序列上，构建得到带有所述核苷酸序列的连接子，之后通过将所述连接子转化到宿主细胞中，得到含有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的重组载体；步骤二、利用第一对突变引物，以步骤一得到的重组载体为模板，通过聚合酶链式反应方法进行循环延伸扩增得到PCR产物；以及，步骤三、分别利用第二对突变引物和第三对突变引物，以步骤二中得到的PCR产物为模板，再次通过聚合酶链式反应方法进行循环延伸扩增得到对应的PCR产物，之后通过将再次得到的对应的PCR产物各自转化到不同的宿主细胞中，以得到含有突变位点的目的重组载体。优选的是，所述的产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法中，所述步骤三中，将再次得到的PCR产物转化到宿主细胞中之前，还包括将再次得到的PCR产物利用DpnI内切酶于温度37℃下处理3h。优选的是，所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组合物，其含有一种酶，其特征在于，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种组合物，其含有一种酶，其特征在于，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代一个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质：所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第335位的天冬酰胺、第341位的谷氨酰胺和第343位的丝氨酸均被取代为色氨酸，或，所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列第336位的丝氨酸被取代为苯丙氨酸、第341位的谷氨酰胺被取代为色氨酸和第343位的丝氨酸被取代为色氨酸，或，所述酶为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第341位的谷氨酰胺和第343位的丝氨酸均被取代为色氨酸。2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1中所述的酶。3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。4.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的重组载体。5.一种产生编码酶突变体的核苷酸序列的方法，其特征在于，包括：步骤一、从桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16中克隆得到如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，并将所述多核苷酸序列连接到用于表达的调节序列上，构建得到带有所述核苷酸序列的连接子，之后通过将所述连...
【专利技术属性】
技术研发人员：宗志友，张东远，高乐，王国坤，李晨，崔超，陈树林，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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