本发明专利技术涉及具有内切葡聚糖酶活性的家族5的糖苷水解酶变体，编码所述家族5的糖苷水解酶变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞，以及使用所述家族5的糖苷水解酶变体的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有内切葡聚糖酶活性的多肽 专利
本专利技术涉及具有内切葡聚糖酶活性的家族5的糖苷水解酶变体，编码所述家族5 的糖苷水解酶变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞，以及使用所述家族5 的糖苷水解酶变体的方法。 专利技术背景 纤维素是植物初生细胞壁的结构组分，并且可能是地球上存在的最丰富的有机化 合物之一。纤维素是由几个0 (1 - 4)连接的葡萄糖单元的直链构成的多糖聚合物。为了 利用单个葡萄糖单元，必须将多糖水解。这可以使用纤维素酶这类催化纤维素水解的酶类 来实现。 许多微生物产生水解0-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二 糖水解酶和葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置处消化纤维素聚合物，将其打开以 被纤维二糖水解酶攻击。 纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖水解酶 I是一种1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维三糖或任何含有0 -1，4 连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-f3 -D-葡萄糖苷键的水解，从链的还原末端释放纤维二 糖。纤维二糖水解酶II是一种1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维三 糖或任何含有0 -1，4连接的葡萄糖的聚合物中的1，4--D-葡萄糖苷键的水解，从链的非 还原末端释放纤维二糖。纤维二糖是葡萄糖的水溶性的0-1，4连接的二聚体。 e-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，葡萄糖随后可以与其他物质一样发酵 成乙醇。 鉴定具有改进的性质，例如提高的水解速率、更好的热稳定性、向木质素的吸附降 低和除了水解纤维素之外还水解生物质的非纤维素组分例如半纤维素的能力的新的内切 葡聚糖酶，在本领域中将是有利的。对半纤维素具有广范围的副活性的内切葡聚糖酶，对于 提高复杂的、富含半纤维素的生物质底物的总水解得率，可能是特别有益的。 本专利技术的目的是提供具有内切葡聚糖酶活性的改进的多肽以及编码所述多肽的 多核苷酸。 专利技术概述 本专利技术提供了多核苷酸和由其编码的多肽，所述多肽已被鉴定为具有羧甲基纤维 素酶活性（CMC)的内切葡聚糖酶。 根据本专利技术的一个方面，提供了新的酶及其活性类似物和片段。 根据本专利技术的另一方面，提供了分离的本专利技术的多肽以及这样的酶的活性片段。 根据本专利技术的又一方面，提供了通过重组技术生产这样的多肽的方法，所述方法 包括将含有编码本专利技术的酶的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，在促进所述酶的 表达和随后所述酶的回收的条件下进行培养。 根据本专利技术的又一方面，提供了利用这样的酶或编码这样的酶的多核苷酸来水解 纤维素的方法。根据本专利技术的又一方面，提供了将这样的酶用于燃料生产的方法。 从本文中的教示内容，本专利技术的这些以及其他方面对于本领域技术人员来说将是 显而易见的。 附图简述 从如附图中所示的本专利技术的下列描述，本专利技术的其他目的和特点将变得更加明 显，在所述附图中： 图1示出了如何在本专利技术提供的变体上进行初级筛选的示意图；以及 图2示出了本专利技术的内切葡聚糖酶变体的糖化性能。 专利技术详述 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种家族5的糖苷水解酶变体，所述变体由野 生型亲代多核苷酸的突变形式编码，所述突变形式与SEQ ID NO :1的（cDNA)核苷酸序列具 有至少 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列核苷酸残基变化： 157 至 159 位处的核苷酸是 TCT ; (SEQ ID NO :3) 175 至 177 位处的核苷酸是AAG;(SEQIDNO:5) 175 至 177 位处的核苷酸是CAT;(SEQIDNO:7) 181 至 183 位处的核苷酸是CCT;(SEQIDNO:9) 190 至 192 位处的核苷酸是 AAT ; (SEQ ID NO : 11) 208 至 210 位处的核苷酸是 ATG ; (SEQ ID NO : 13) 259 至 261 位处的核苷酸是 CAT ; (SEQ ID NO : 15) 259 至 261 位处的核苷酸是 ATG ; (SEQ ID NO : 17) 274 至 276 位处的核苷酸是 GCT;(SEQ ID NO:19) 547 至 549 位处的核苷酸是 TTG;(SEQ ID NO :21) 550 至 552 位处的核苷酸是 GAG ; (SEQ ID NO :23) 574 至 576 位处的核苷酸是AAT;(SEQIDNO:25) 589 至 591 位处的核苷酸是GCT;(SEQIDNO:27) 595 至 597 位处的核苷酸是 ATG;(SEQ ID NO :29) 598 至 600 位处的核苷酸是 GTT ; (SEQ ID NO :31)和 898 至 900 位处的核苷酸是 GCG;(SEQ ID NO :33) 其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，0-甘露聚糖酶活性， 外切-1，3-葡聚糖酶活性，内切-1，6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷 酶活性；并且其中所述变体的活性高于由具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的野生型亲代多 核苷酸编码的多肽。 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种家族5的糖苷水解酶变体，其中所述家族5 的糖苷水解酶变体具有内切葡聚糖酶活性。 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种表达盒、载体或克隆载体，其包含上文中提 出的野生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO :1的突变形式，其中任选地所述克隆载体包含病 毒载体、质粒、噬菌体、噬粒、粘粒、福斯质粒、细菌噬菌体或人工染色体，并且任选地所述病 毒载体包含腺病毒载体、反转录病毒载体或腺相关病毒载体，并且任选地所述克隆载体包 含细菌人工染色体（BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体（PAC)、酵母人工染色体（YAC)或 哺乳动物人工染色体（MAC)。 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种转化的细胞，其包含含有上文中提出的野 生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO :1的突变形式的核酸或所述表达盒、载体或克隆载体，其 中任选地所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种转化的细胞，其包含上文中提出的表达载 体。 在一种实施方式中，本专利技术提供了一种转化的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺 乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一种实施方式中，所述细菌细胞选自运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)、大 肠埃希式杆菌（Escherichia coli)和产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)。在一种实施方式中，所述酵母细胞选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、 葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)、脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸 克鲁维酵母（Kluyvero本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家族5的糖苷水解酶变体，所述变体由野生型亲代多核苷酸的突变形式编码，所述突变形式与SEQ ID NO：1的(cDNA)核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列核苷酸残基变化：157至159位处的核苷酸是TCT；175至177位处的核苷酸是AAG；175至177位处的核苷酸是CAT；181至183位处的核苷酸是CCT；190至192位处的核苷酸是AAT；208至210位处的核苷酸是ATG；259至261位处的核苷酸是CAT；259至261位处的核苷酸是ATG；274至276位处的核苷酸是GCT；547至549位处的核苷酸是TTG；550至552位处的核苷酸是GAG；574至576位处的核苷酸是AAT；589至591位处的核苷酸是GCT；595至597位处的核苷酸是ATG；598至600位处的核苷酸是GTT；和898至900位处的核苷酸是GCG；其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β‑甘露聚糖酶活性，外切‑1,3‑葡聚糖酶活性，内切‑1,6‑葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述变体的活性高于由具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的野生型亲代多核苷酸编码的多肽。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·普兰德，贾斯汀·T·斯蒂格，
申请(专利权)人：BP北美公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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